| 研究課題/領域番号 |
16K20657
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| 研究機関 | 日本大学 |
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研究代表者 |
矢口 学 日本大学, 松戸歯学部, 助手(専任扱) (90732181)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ダウン症候群 / 歯周病 / 口腔細菌 / 遺伝子解析 / 免疫応答 / Porhyromonas gingivalis |
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| 研究実績の概要 |
Down症候群（DS）は歯周病の罹患率が高く，早期に発症し進行が速く重篤であることが知られているが，その機序については未だ不明な点が多い．歯周病原菌Porhyromonas gingivalis（P. g）は，線毛の遺伝子型（fimA）によってⅠからⅤ型に分類されている．日本人の進行性歯周炎患者で検出されたP. gの多くがⅡ型であり，興味深いことにDS患者でもⅡ型P. gが高頻度で検出されるとの報告がある．これらのことから，先行研究の多くで用いられてきたⅠ型ではなく，Ⅱ型P. gがDSにおける重篤な歯周病の惹起に深く関与している可能性が推察される．従って，初年度はⅡ型P. gに焦点を当て，DS歯肉線維芽細胞（DGF）におけるⅡ型P. g由来LPSに対する応答性を検討した．
まず，Ⅰ型P. g（ATCC 33277株）およびⅡ型P. g（TDC60株）より分離・精製したLPSをDGFと健常者歯肉線維芽細胞（NGF）に作用させ，リアルタイムPCR法で炎症の指標となるIL-6，IL-8ならびにCCL20の遺伝子発現を解析した．
その結果，IL-6発現は，Ⅰ型およびⅡ型LPSによってNGFよりもDGFにおいて有意に上昇した．NGFではⅡ型に比べⅠ型LPSによる発現が高かった．IL-8発現は，Ⅰ型LPSによってDGFよりもNGFの方が，Ⅱ型LPSによってDGFの方が有意に上昇した．NGFではⅠ型LPSによる発現が有意に高く，DGFではⅡ型LPSの方が有意に高かった．CCL20発現は，Ⅱ型LPSによってNGFよりもDGFにおいて有意に上昇した．興味深いことに，LPS非刺激のDGFでもIL-6，IL-8ならびにCCL20遺伝子発現が有意に高く検出された．
以上のことから，DSにおける重篤な歯周病の発症と病態進展には異常な遺伝的背景因子とⅡ型P. gのLPSが深く関与している可能性が考えられた．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Down症候群 (DS) における歯周病の有無と免疫担当細胞の機能異常の関連性について明らかにする目的で，初年度はフローサイトメトリー法を用いてDS患者の末梢血中における免疫担当細胞の分画解析を行う予定であったが，サンプル採取が困難であり実施できていない状況である．
しかしながら，DS歯肉線維芽細胞を用いた予備実験によりDSにおける重篤な歯周病の発症と病態進展に，DSの持つ異常な遺伝的背景因子とfimAⅡ型P. gingivalisのLPSが深く関与している可能性を示す新たな知見が得られたことは，本研究計画を展開していくにあたり，重要な足がかりになったと考えている．
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| 今後の研究の推進方策 |
DS歯肉線維芽細胞におけるfimAⅡ型P. gingivalis由来LPSに対する応答性をより明確にするために，DNAマイクロアレイ解析により遺伝子発現変動を網羅的に解析する．発現変動を認めた遺伝子については，Ingenuity Pathways Analysis (IPA) を用いて遺伝子ネットワーク/パスウェイ解析を行い，real time PCR法にて遺伝子発現を確認する．
さらに，炎症反応において重要な役割を果たしている転写因子nuclear factor-kappa B (NF-κB) を中心とした細胞内シグナル伝達系についても詳細な検証が必要であると考える．
なかでも，近年NF-κBの活性化を抑制する分子機構についても注目されていることから，ウェスタンブロット法を用いてNF-κBの核移行に関連する抑制系に働くタンパクの発現を確認していく予定である．
一方，課題である末梢血サンプル採取については引き続き対応策の検討を行っていく．
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| 次年度使用額が生じた理由 |
本年度はLPS分離・精製，細胞培養ならびに遺伝子発現解析が主体であり，経費の主要な用途は，主に消耗品である．培養培地，抗生物質，ウシ血清や培地用ディッシュ，ピペットやチップなどのプラスチック器具，real time PCR関連試薬類などに使用した．
また，予備実験のために複数の正常歯肉線維芽細胞株を購入したが，年度末に納期未定の一部の細胞株の購入を中止したことにより差額が生じた．
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| 次年度使用額の使用計画 |
次年度は，使用頻度の高い培養培地，抗生物質，ウシ血清や培地用ディッシュ，ピペットやチップなどのプラスチック器具，real time PCR関連試薬類などの消耗品に加えて，DNAマイクロアレイ解析にかかる費用，さらにはタンパク発現解析で使用する抗体などに使用する．また，予備実験で使用するヒトT細胞株であるJurkat細胞を購入予定である．
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