| 研究課題/領域番号 |
16K20871
|
|---|
| 研究機関 | 北海道大学 |
|---|
研究代表者 |
野川 奈津子 北海道大学, 大学病院, 医員 (80757360)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2021-03-31
|
| キーワード | PCFT / HFM / SLC46A1 / deep intronic mutation / PCR法 |
|---|
| 研究実績の概要 |
葉酸はDNA合成、アミノ酸合成に必須の補酵素であり、欠乏により巨赤芽球性貧血、免疫不全症状、神経症状などを来す。妊婦で葉酸が欠乏すると、胎児の神経管形成障害リスクが上昇する。この葉酸を先天的に吸収できない遺伝性葉酸吸収不全症（Hereditary folate malabsorption, HFM)は1961年初報告され、2014年現在全世界で31の報告がある。
2014年に申請者らは、本邦初となるHFM患者について報告した。その患児について、申請者らは葉酸輸送体proton-coupled folate transporter(PCFT)のコード遺伝子SLC46A1に未報告の変異があることを発見した。当該患児は重症免疫不全症状、神経症状を有していた。過去の報告によれば、後遺症なく治療が奏効した例はほとんどない。本研究の目的は、当該遺伝子変異について機能解析を進め、遺伝性葉酸吸収不全症に対する有効な治療基準を確立することである。
我々が報告した遺伝性葉酸吸収不全症患児の遺伝子変異のうち、ひとつは重要なアミノ酸置換を生じることが過去の報告で予測されており、SNPとして登録のない重要な変異である。一方のdeep intronic mutationについては、通常転写されるエクソンと距離のあるイントロン部位での新規変異であり、転写以降の過程に及ぼす影響は不明である。
申請者らは平成28年度中、当該イントロンを挟む両側エクソン上にプライマーを設計し、PCR法により転写レベルでの配列を解析した。患児の葉酸吸収不全が、両親由来の遺伝子変異が組み合わせられたことによることを確認した。
また、平成29年度中、患児由来EBV-LCLを樹立し、血球系へのPCFT loss-of-functionの影響の有無と、治療に必要な血液中の葉酸最小濃度の検討を行った。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画では、患児由来EBV-LCLを樹立し、血球系へのPCFT loss-of-functionの影響の有無と、治療に必要な血液中の葉酸最小濃度を検討する予定であった。
上記に加え、両親由来の各々の変異SLC46A1を有したGFP発現ベクターをHeLa細胞に一時的に導入し、細胞内の局在の変化を確認する予定であった。また、樹立した患児由来EBV-LCLを葉酸濃度勾配下で一定時間培養し、細胞周囲解析でS期停滞が生じているかを調べる予定であった。
しかし、予定した実験を行ってはいるものの、実験結果がまだ安定しておらず、その原因を未だ探索中であるため、当初の計画よりも進捗状況に若干の遅れがみられる。
|
| 今後の研究の推進方策 |
平成30年度以降は、現在のエフォートを維持しながら、当初予定していた研究計画を引き続き施行する。
具体的な研究内容として、両親由来の変異SLC46A1を有したGFP発現ベクターをHeLa細胞に一時的に導入し、細胞内の局在の変化を確認する。樹立した患児由来EBV-LCLを葉酸濃度勾配下で一定時間培養し、細胞周囲解析でS期停滞が生じているかを確認する。
上記ののち、患児と同等の変異を有した神経系細胞株を生じて髄液中の必要濃度の検索を行う。患児由来EBV-LCLに正常配列SLC46A1を導入し増殖能の回復を観察する。PCFT機能欠失細胞株HeLa R1-11細胞と通常HeLa細胞について、葉酸濃度勾配における増殖能を解析する。HeLa R1-11細胞に正常配列SLC46A1を導入した細胞株を樹立し、増殖能の差を調べる。PCFT機能欠失株について、HeLa細胞およびEBV-LCLに正常配列及び変異配列SLC46A1を導入し、蛍光抗体標識したメソトレキサートの取り込みから機能解析を行う。
解析データがまとまり次第、学術論文投稿、学会発表を予定している。
|
| 次年度使用額が生じた理由 |
当初予定していた研究計画に遅れが生じたため、必要物品の購入計画にも遅延が生じ、平成29年度使用額を次年度に繰り越す必要が生じた。平成30年度に前年度の繰り越し分を使用し、研究を遂行する。これまで参加できなかった学会等にも積極的に参加していく予定である。
|
