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本年度はまずDoublesex発現細胞の標識と脳内分布の調査のため、前年度に作成した抗コオロギDoublesex抗体を用いた免疫組織化学法による脳内Doublesexタンパク質の発現解析を行った。しかし前年度に作成したいずれの抗血清を用いても、コオロギ脳内でDoublesexタンパク質を検出することができなかった。その理由として、作成した抗体が標的タンパク質を正しく認識できていない可能性と、そもそもDoublesexタンパク質の発現量が検出限界以下である可能性が考えられた。
上記の実験と並行して、CRISPR/Cas9 systemを利用したGeneTrap 系統の作成も進めた。コオロギ受精卵にCas9タンパク質とdoublesex遺伝子のイントロン領域を標的としたgRNAを顕微微量注入し胚発生を進めた胚を得たところ、~8割の胚においてinsertion/deletionが生じていることが明らかとなった。次に、Cas9タンパク質、gRNAとともにGeneTrap vectorをコオロギ受精卵に顕微微量注入し、GeneTrap系統を樹立することを試みた。しかし、この実験を行なっている間に、本研究室で維持しているコオロギ個体群に致死性のウイルスが感染し実験の継続が困難な状況となってしまった。
これまでに、コオロギ脳ではfruitless遺伝子が性決定に寄与しないという結果を得ていた。
昆虫におけるfruitless遺伝子の分子進化解析により、コオロギを含む多新翅上目昆虫やそれよりも原始的な昆虫においてはfruitless遺伝子が性決定に寄与しないであろうこと、カメムシを含む準新翅上目においてfruitless遺伝子の性特異的遺伝子産物を生じさせうる新規なプロモーターの獲得が起こったことを明らかにした。
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