| 研究課題/領域番号 |
16K20891
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
山形 聡 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (50769940)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | CRFニューロン |
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| 研究実績の概要 |
我々はこれまでに視床下部培養細胞系を用いて、レプチンはCRF遺伝子発現を刺激することを明らかにした。本研究では、レプチンがCRFニューロンを刺激する視床下部内メカニズムの解明を目的とする。レプチンの作用機序として、CRF ニューロンへの直接作用、視床下部局所回路[グルタミン酸（Glu）作動性, GABA作動性ニューロン]を介する作用のほか、シナプス前への逆行性伝達物質を介する作用の可能性もある。実験に用いるのは新たに開発されたCRFニューロン蛍光可視化マウスを用いた電気生理学的手法である。また糖質コルチコイドがレプチン作用に及ぼす効果についても検討する。そこでまずCRFニューロン蛍光可視化マウス（CRF-Venusマウス）におけるVenus陽性ニューロンの性格づけを行うため、急性脳スライスを用い以下の電気生理学的検討を行った。視床下部室傍核におけるVenusニューロンを-60mVに電位固定し興奮性シナプス後電流（EPSC）を観察した。EPSCがnon-NMDA拮抗薬 CNQX（20μM）およびNMDA拮抗薬AP5（100μM）で遮断されることを確認した。よってVenus陽性ニューロンにグルタミン酸作動性入力が存在することが証明された。次にgramicidin添加により細胞内Clイオンがピペット内液に置き換わるのを抑えた条件で、CNQX、AP5存在下で抑制性後シナプス電流（IPSC）を観察した。IPSCはGABA受容体アンタゴニストであるgabazine（20μM）で完全に消失した。よってVenus陽性ニューロンにGABA作動性入力が存在することが証明された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
corticosteroneの投与については計画では高用量corticosteroneペレット皮下植え込みを予定していたが安定せず、AlZet浸透圧ポンプに変更して予備実験を行っている。研究者の所属機関の異動に伴う動物実験計画書の認定や第二種使用等拡散防止措置確認申請までに時間を要した。先の書類申請後でなければマウス精子を搬入できないため、実験に使用するマウス（CRF-VenusΔNeo）の精子保存や搬送が予定より3-4か月程遅れた。そのため精子を用いた体外受精を開始できたのがH30年に入ってからとなり、実験に必要なマウス匹数を用意できておらず進捗が遅れている。ただし今後実験を行う準備は順調である。
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| 今後の研究の推進方策 |
マウスの交配ペースを速め実験に備える。CRFニューロンを蛍光可視化したCRF-Venusマウスを用い, 視床下部室傍核を含む急性スライスを用いてwhole cell clampを行う.高用量corticosterone持続負荷（Alzetポンプ使用）または両側副腎摘除(ADX)を行い,慢性のGC過剰および欠乏状態とする. 次にGC慢性過剰と欠乏がCRFニューロンへのGlu作動性、およびGABA作動性入力に及ぼす影響を対照マウスと比較し電気生理学的に検討する.
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウス実験に係る必要物品およびマウス飼育や購入に必要な経費を支出したが、マウス準備過程で予定よりも計画が遅れており余剰金が生じた。次年度、引き続きマウス管理と物品に使用する予定である。
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