| 研究課題/領域番号 |
16K20891
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| 研究機関 | 弘前大学 |
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研究代表者 |
山形 聡 弘前大学, 医学部附属病院, 助教 (50769940)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | レプチン / CRFニューロン |
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| 研究実績の概要 |
視床下部培養細胞系を用いて、レプチンはCRF遺伝子発現を刺激することを明らかにした。本研究では、レプチンがCRFニューロンを刺激する視床下部内メカニズムの解明を目的とする。レプチンの作用機序として、CRF ニューロンへの直接作用、視床下部局所回路[グルタミン酸（Glu）作動性, GABA作動性ニューロン]を介する作用のほか、シナプス前への逆行性伝達物質を介する作用の可能性もある。実験に用いるのは新たに開発されたCRFニューロン蛍光可視化マウスを用いた電気生理学的手法である。また糖質コルチコイドがレプチン作用に及ぼす効果についても検討する。そこでまずCRFニューロン蛍光可視化マウス（CRF-Venusマウス）におけるVenus陽性ニューロンの性格づけを行うため、急性脳スライスを用い以下の電気生理学的検討を行った。視床下部室傍核におけるVenusニューロンを-60mVに電位固定し興奮性シナプス後電流（EPSC）を観察した。EPSCがnon-NMDA拮抗薬 CNQX（20μM）およびNMDA拮抗薬AP5（100μM）で遮断
されることを確認した。よってVenus陽性ニューロンにグルタミン酸作動性入力が存在することが証明された。次にgramicidin添加により細胞内Clイオンがピペット内液に置き換わるのを抑えた条件で、CNQX、AP5存在下で抑制性後シナプス電流（IPSC）を観察した。IPSCはGABA受容体アンタゴニストであるgabazine（20μM）で完全に消失した。よってVenus陽性ニューロンにGABA作動性入力が存在することが証明された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
ステロイド投与を行うAlZet浸透圧ポンプ使用に関する技術的な習熟、予備実験に時間を要した。また新規動物実験計画書の認定や第二種使用等拡散防止措置確認申請までに時間を要し開始が遅れた。飼育施設のスペースの関係上、マウスの交配/飼育数に制限がある。免疫染色（Venus）の条件設定に時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
免疫染色（Venus）に関し、抗体のメーカーやロット変更、また蛍光抗体ではなくDAB等他の方向を検討する。これらも成功しない場合は、抗CRF抗体を用いて継続する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
マウス実験に係る必要物品およびマウス飼育や購入に必要な経費を支出したがマウス準備過程で予定よりも計画が遅れており余剰金が生じた。次年度、引き続きマウス管理と物品に使用する予定である。
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