高リスク小児急性骨髄性白血病における多角的な遺伝子解析を用いた分子標的の同定

2016 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K20951
• 研究機関: 群馬大学
• 研究代表者: 柴 徳生 群馬大学, 医学部附属病院, 助教 (50600615)
• 研究期間 (年度): 2016-04-01 – 2019-03-31
• キーワード: メチル化アレイ / 急性骨髄性白血病 / 小児

研究実績の概要

AMLは様々な遺伝子異常を原因とするヘテロな疾患であり、これまでに染色体分析、遺伝子変異解析、遺伝子発現解析などが行われてきた。今回、イルミナ社のInfinium Methylation Assay HumanMethylation 450を用いて、小児急性骨髄性白血病（AML）初発検体64例に対して網羅的DNAメチル化アレイを実施した。プローブは約800,000CpGサイト（約21,000遺伝子）で、遺伝子の99％およびCpGアイランドの96％以上をカバーしており、ゲノムワイドな解析が可能な手法である。今回のメチル化アレイにより、t(8;21)やMLL遺伝子再構成など、各遺伝子異常に対し、それぞれ異なったメチル化パターンが形成されていることが判明した。今後、このメチル化パターンを詳細に解析することにより、遺伝子異常と予後予測について新たな知見が得られるものと考えられ、さらにDNAメチル化変化と遺伝子発現変化が相関する遺伝子群を抽出し、DNAメチル化により発現制御を受ける候補遺伝子の同定を試みることで、新規の分子標的薬の開発につなげていきたいと考えている。現在、遺伝子相互の関連性について、クラスタリング解析、パスウェイ解析を含めたバイオインフォマティクスの手法を用いて統合的に解析を行っており、機能的に関連する候補遺伝子・ハブ遺伝子の絞り込みを行っている。また、次世代シーケンサーを用いて、分子生物学的な背景が不明な正常核型を中心に約100例の検体を用いて、クロマチン修飾関連遺伝子についてTarget sequenceを施行した。その結果、予後不良例においては有意にクロマチン修飾関連遺伝子の変異が起こっていることを同定した。今後、マイクロRNAの発現解析やプロテオーム解析を行うことで、より統合的な解析を行っていく予定である。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

当初の計画通り、イルミナ社のInfinium Methylation Assay HumanMethylation 450を用いて、小児急性骨髄性白血病（AML）初発検体64例に対してDNAメチル化アレイを実施した。プローブは約800,000CpGサイト（約21,000遺伝子）で、遺伝子の99％およびCpGアイランドの96％以上をカバーしており、ゲノムワイドな解析が可能な手法である。今回のメチル化アレイにより、PRDM16やEVI1の発現の有無、t(8;21)やMLL遺伝子再構成などの融合遺伝子、KITやFLT3-ITD変異などの各遺伝子異常に対し、それぞれ異なったメチル化パターンが形成されていることが判明した。今後、より詳細にメチル化パターンを解析することにより、遺伝子異常と予後予測について新たな知見が得られるものと考えられ、さらにDNAメチル化変化と遺伝子発現変化が相関する遺伝子群を抽出し、DNAメチル化により発現制御を受ける候補遺伝子の同定を試みることで、新規の分子標的薬の開発につなげていきたいと考えており、治療ターゲットとなる分子標的の同定を目指す。現在、遺伝子相互の関連性について、クラスタリング解析、パスウェイ解析を含めたバイオインフォマティクスの手法を用いて統合的に解析を行っており、機能的に関連する候補遺伝子・ハブ遺伝子の絞り込みを行っている。

今後の研究の推進方策

遺伝子異常や遺伝子発現パターンから24～36例程度を抽出して、microRNAシーケンスを施行したいと考えている。microRNAシーケンスでは、microRNA 発現も同時に測定できることから、既知の発症に重要な役割を果たしていると考えられるmiR-125、miR181などに加え、新規のmicroRNAを同定したいと考えている。また、ｍRNAの発現量が高くても、産生されるたんぱく質の量は必ずしも相関する訳ではないため、実際の細胞内でどのような酵素やたんぱく質がどのくらいの量産生されているかを突き止めることが今後の分子標的を探る上で重要な要素であると考えられる。これまでに培ってきたPRDM16, EVI1等の遺伝子発現、および遺伝子異常を組み合わせたカテゴライズ技術を用いて、種々のAML細胞を利用して、iMPAQT法を用いて、たんぱく質の網羅的な全定量を行い、分子標的の同定を目指したいと考えている。特に、PRDM16, EVI1ではHOX pathwayが活性化されているため、HOX pathwayの活性を阻害する標的を同定することは新規薬剤の開発につながることが期待される。

研究成果

• [雑誌論文] ASXL2 mutations are frequently found in pediatric AML patients with t(8;21)/ RUNX1-RUNX1T1 and associated with a better prognosis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yamato G, Shiba N, Yoshida K, Shiraishi Y, Hara Y, Ohki K, Okubo J, Okuno H, Chiba K, Tanaka H, Kinoshita A, Moritake H, Kiyokawa N, Tomizawa D, Park MJ, Sotomatsu M, Taga T, Adachi S, Tawa A, Horibe K, Arakawa H, Miyano S, Ogawa S, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Genes Chromosomes Cancer. 巻: 56 ページ: 382-393
  • DOI: 10.1002/gcc.22443.
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [雑誌論文] Prognostic impact of specific molecular profiles in pediatric acute megakaryoblastic leukemia in non-Down syndrome. (2017)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Shiba N, Ohki K, Tabuchi K, Yamato G, Park MJ, Tomizawa D, Kinoshita A, Shimada A, Arakawa H, Saito AM, Kiyokawa N, Tawa A, Horibe K, Taga T, Adachi S, Taki T, Hayashi Y.
  • 雑誌名: Genes Chromosomes Cancer. 巻: 56 ページ: 394-404
  • DOI: 10.1002/gcc.22444
  • 査読あり / 謝辞記載あり
• [学会発表] Transcriptome Analysis Revealed the Entire Genetic Understanding of Pediatric Acute Myeloid Leukemia with a Normal Karyotype (2016)
  • 著者名/発表者名: Shiba N, Yoshida K, Shiraishi Y, Hara Y, Yamato G, Kaburagi K, Sanada M, Ohki K, Park MJ, Tomizawa D, Chiba K, Tanaka H, Sotomatsu M, Arakawa H, Horibe K, Taga T, Adachi S, Tawa A, Miyano S, Ogawa S and Hayashi Y.
  • 学会等名: 58th Annual Meeting of the American Society of Hematology（ASH)
  • 発表場所: San Diego
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] Identification of two distinct poor prognostic subgroups related to high expression of BMP2 or PRDM16 in pediatric AML (2016)
  • 著者名/発表者名: Hara Y, Yamato G, Shiba N, Okubo J, Ohki K, Park MJ, Sotomatsu M, Tomizawa D, Taki T, Kinoshita A, Kiyokawa N, Taga T, Arakawa H, Tawa A, Horibe K, Adachi S and Hayashi Y
  • 学会等名: 58th Annual Meeting of the American Society of Hematology（ASH)
  • 発表場所: San Diego
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] Retrospective Evaluation of Correlations Between Genetic Backgrounds and Stem Cell Transplantation for De Novo Pediatric Acute Myeloid Leukemia (2016)
  • 著者名/発表者名: Kaburagi T, Yamato G, Shiba N, Hara Y, Ohki K, Ichikawa H, Park MJ, Shimada A, Sotomatsu M, Arakawa H, Horibe K, Adachi S, Taga T, Tawa A, Hayashi Y
  • 学会等名: 58th Annual Meeting of the American Society of Hematology（ASH)
  • 発表場所: San Diego
  • 年月日: 2016-12-03 – 2016-12-06
  • 国際学会
• [学会発表] Integrated genetic analysis using next generation sequencing in pediatric AML (2016)
  • 著者名/発表者名: 柴 徳生
  • 学会等名: 第75回日本がん学会学術集会
  • 発表場所: 横浜
  • 年月日: 2016-10-06 – 2016-10-08
  • 招待講演