研究課題
本研究では、アルカン合成を担う２つの酵素であるAARとADの酵素の改変と大腸菌内でアルカン合成を妨げる様々な因子を除き、アルカン合成に特化した大腸菌の創出を目指した。AARの活性を測定するには、精製したAARを用いた試験管内反応の溶液、あるいは、AARを発現した大腸菌とその培養液からAARの反応生成物であるアルデヒドを抽出し、GC-MSで定量するといった多段階プロセスを必要とした。そのため、ハイスループット性に乏しく、多くの時間と労力を要した。そこで、申請者が開発した大腸菌を用いることで、外部から菌体の発光量をモニターすることで、菌体内で発現したAARによるアルデヒド生成量を非侵襲帝にに検出が可能となり、評価方法が格段に簡便となった。しかしながら、コロニーの発光を検出するためにはX線フィルムへの露光を利用していたため、検出のダイナミックレンジが狭く、発光の経時変化や積算量を調べることが困難であった。そこで、高感度化学発光検出器を応用し、発現条件の検討、メンブレンを利用したコロニーのトランスファー方法を改良することにより、寒天培地上に形成した数千種の変異体AARを有するコロニーの菌体内アルデヒド生成量の経時変化と積算値を、各コロニーの発光量としてリアルタイムに、かつ感度よく同時に検出することに成功した。その結果、１回のアッセイで数千種の変異体AARを発現するコロニーから、野生型AARを発現したコロニーよりも強く発光するコロニーを100個以上検出することができ、本手法の強力なハイスループット性が実証された。本手法の確立により、高活性変異体AARの高速スクリーニングが可能となっただけでなく、アルカン生成に特化した大腸菌の創出に向けた大腸菌の遺伝子破壊株ライブラリの探索を飛躍的に加速できる技術となった。
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月刊 ファインケミカル
巻: 46 ページ: 19-25
