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H29年度に実施予定であったヒトiPS細胞の脱細胞化海綿骨への播種実験を、時期を早めてH28年度に行った。骨髄マトリックスがiPS細胞に与える影響を明らかにするため、オンフィーダー培養およびフィーダーレス培養を試みた。本研究課題では、脱細胞化海綿骨の骨髄マトリックスの再細胞化を目的としているため、骨髄マトリックスを損傷させることのないよう、脱細胞化海綿骨上に細胞懸濁液を静かに滴下して播種した。一定期間の培養後、染色により、iPS細胞の脱細胞化海綿骨への接着、増殖、分化について検討した。骨髄マトリックス上でiPS細胞を培養した場合、iPS細胞が骨髄を構成する種々の細胞（間葉系幹細胞や血管内皮細胞などの造血ニッチ構成細胞と造血細胞）へと分化することを期待した。しかし、iPS細胞の脱細胞化海綿骨への接着性は、接着細胞用の培養皿と比較すると、極めて低く、播種方法の検討が必要であることが明らかになった。そこで、まずはiPS細胞の脱細胞化海綿骨への播種条件として、播種密度、フィーダー細胞の有無および密度、培養液の種類、脱細胞化海綿骨へのラミニンなどの細胞接着分子のコーティングなどについて検討した。その結果、iPS細胞の播種密度を通常の培養皿での播種密度よりも上げることで、細胞の接着性が向上することが明らかになった。また、培養皿上で培養したiPS細胞が細胞増殖によって二次元的にコロニーのサイズが大きくなるのに対し、骨髄マトリックスに接着したiPS細胞は、三次元的に増殖し、コロニー形成を行っていた。以上より、脱細胞化海綿骨を用いて三次元的にiPS細胞を培養することで、これまでの二次元培養とは異なるコロニー形成を行うことが示され、生体内により類似した環境でのiPS細胞の培養が可能となることがわかった。
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