| 研究課題/領域番号 |
16K21066
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| 研究機関 | 信州大学 |
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研究代表者 |
吉長 恒明 信州大学, 学術研究院医学系(医学部附属病院), 助教 (30770226)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | フィブリノーゲン型アミロイドーシス |
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| 研究実績の概要 |
fibrinogenAα鎖遺伝子の4899_4902delAGTG変異が導入されたヒト型fibrinogenを産生するChinese Hamster Ovary(CHO)細胞の検体を用いて解析を行った。細胞培養の途中で採取される培養上清（細胞外成分）とCHO細胞自体を破壊して採取される細胞破砕液（細胞内成分）を用いた。
異常fibrinogenAα部位の検出を優先とし、細胞破砕液においてはSDS-PAGEし、通常のCBB染色と免疫沈降法(抗フィブリノーゲン抗体)を用いた高感度の方法で実験を施行したが、数か所の陽性バンド部位からはAα鎖自体が検出されないという結果であった。
次に抗fibrinogen抗体と抗fibrinogenAα鎖抗体を用いて上清と細胞破砕液を用い、プロテインAセファロースなどを用いたところ、結果は同じ位置のバンド検出であったが、ウェスタンブロッティングの陽性部位と照らし合わせ、陽性バンド以外を狙ってfibrinogenAα検出部位をバンド上で同定することができた。
同解析の質量分析の結果では正常fibrinogenAα鎖検体では600の末端近くのペプチドまで検出されるが、異常fibrinogenAα鎖検体では475近傍までのペプチドまでで、その後は検出できていなかったため、生成された蛋白は正常型に比べ、より不安定で分解しやすいことが質量分析結果からも推測された（ウェスタンブロッティングでは確認済）。
現在はSDS-PAGEでゲル内で分離した試料を網羅的にLC-MS/MSし、これまでのデータも含めデノボシークエンスを用いて、通常のデータベース（Uniprotなど）に引っ掛からないペプチド由来のデータから変異ペプチドの断片が検出できてできないか検討をしている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
変異fibrinogenのC末端側の変異部位の検出にいたっておらず、培養上清と細胞内でのfibrinogenの生成、細胞外移送における細かい病態機序の同定に至っていない。本変異を有する患者血漿からは異常fibrinogenが検出できなかったことから異常Aα鎖をもつフィブリノーゲンは早期の段階で生体内のプロテアーゼで分解されており、その断片が一部アミロイド構造にいたって腎臓などに沈着すると想定している。
C末端側の変異がどの位置にたまっているかが判明しないため、その生成前後でのプロテアーゼでの介入に至っていない。
以上のことから「やや遅れている」と判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
質量分析にかけるなどして変異部位のペプチドの検出が行えるように複数の方法を検討している。データベースで引っ掛からない場合にも、残りのペプチドからデノボシークエンスをかけることが未同定の蛋白やペプチドの同定に有用だということがわかってきたため、過去のデータを用いて、デノボシークエンスを行っている。他のTTR（トランスサイレチン）の検出にはMALDI-TOFを利用し、TTRそのものを検出しているため、今度はフィブリノーゲンと変異フィブリノーゲンそのものを検出できないか検討を重ねている
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| 次年度使用額が生じた理由 |
C末端側の変異がゲルのどの位置にたまっているかが判明しないため、その生成前後でのプロテアーゼでの介入に至らず、プロテアーゼ試薬やペプチドの注文に至らなかったため、次年度使用額は平成30年度請求額と合わせて変異ペプチドの同定とプロテアーゼを用いた介入前後での検出率の有無などの研究に使用する予定である。
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