研究課題
本研究の目的は、多数のリン酸化タンパク質と相互作用する14－3－3タンパク質のタンパク質間相互作用（PPI）安定化剤として機能するフシコクシン誘導体の細胞内標的を14－3－3/リン酸化タンパク質/フシコクシンの三者会合体として細胞破砕液から単離することを目的とする。前年度までに、天然フシコクシンの10倍以上のPPI安定可能を有する高活性FC誘導体を見出し、これを共有結合的にビーズに固定した高活性FC誘導体担持ビーズを作成した。本年度はまずアフィニティ精製実験の条件検討を行った。精製タンパク質を使ったモデル実験では、界面活性剤濃度が0.1％のときに最も効率よく三者会合体をプルダウンできることが分かった。一方で、細胞破砕液を調整する際には1％の界面活性剤を使用する。まずは、調整した細胞破砕液を10倍希釈し、最適な界面活性剤濃度に調整してプルダウン実験を行った。しかしながら、細胞破砕液の回収条件を変更しながら何度かプルダウンを試みたものの、いずれの条件においても回収したサンプル中に14-3-3タンパク質が確認されなかった。そこで、標的となるリン酸化タンパク質と14-3-3タンパク質の濃度の低下が標的を回収できない要因であると考え、界面活性剤濃度１％の細胞破砕液を希釈せずにそのままプルダウン実験に用いたところ、回収したサンプル中に14-3-3タンパク質が存在することがウェスタンブロット法によって確認できた。ビーズに結合していないフシコクシン誘導体を競合させることで14-3-3タンパク質が減少することから、非特異的な吸着ではなく、三者会合体を単離出来た可能性が高いことも確かめられた。今後、未同定のリン酸化タンパク質の確認を行う予定である。
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