研究課題
本研究ではインスリン刺激に応答してインスリン受容体の細胞内ドメインと複合体を形成し、インスリンシグナルを負に制御するGrowth factor receptor binding protein 14 (Grb14)の機能解明に向けた研究を行っている。Grb14の構造はRA、PH、BPS、SH2ドメインの４つのドメインより構成され、うち、BPSドメインは受容体チロシンキナーゼの偽基質として機能することが明らかとなっているが、インスリン刺激に応じたインスリン受容体へのリクルート機構は明らかとなっていない。研究代表者はBPSドメイン内部の偽基質領域近傍に、カゼインキナーゼ2（CK2）およびグリコーゲンシンターゼキナーゼ3（GSK-3）によりリン酸化を受ける可能性のあるセリン残基クラスターを見出し、本年度はCK2とGSK-3が共役して当該セリン残基クラスターをリン酸化し、インスリン受容体との親和性に影響を与えるかどうかという点を中心とした検討を行った。１）研究代表者は全長のGrb14およびインスリン受容体細胞内ドメインの組換えタンパク質を調製し、Grb14のインスリン受容体への親和性を表面プラズモン共鳴法により解析した。セリン残基クラスターをグルタミン酸で置換したGrb14変異体と野生型を比較したところ。変異体は有意にインスリン受容体に対する親和性が低下した。２）上記セリン残基クラスター由来の合成ペプチドに対してCK2およびGSK-3を作用させ、発光試薬及び質量分析を用いたin vitroキナーゼアッセイを行ったところ、GSK-3による複数のセリン残基のリン酸化が確認された。３）酵母ツーハイブリッドにより、インスリン受容体とGrb14の野生型および変異体の複合体形成を評価したところ、GSK-3の基質となりうるセリン残基上の負電荷が複合体形成に影響を与える可能性が示唆された。
2: おおむね順調に進展している
本年度、当初の予定通り、Grb14のBPSドメイン内のセリン残基クラスター中の複数のセリン残基が、GSK-3によってリン酸化されることを示唆する結果を得た。また、このリン酸化によって生じる当該セリン残基上の負電荷が、インスリン受容体との複合体形成を抑制することも併せて示唆された。その一方、一般的にGSK-3は、プライミングと呼ばれる予備的なリン酸化を必要とし、CK2はその候補と考えられたが、CK2はこの作業仮説に反し、当該セリン残基クラスター中のGSK-3プライミングサイトとなるセリン残基をリン酸化しないことが示唆された。現在までに、Grb14の機能調節に関わる因子と調節機構の全容を解明できたわけではないが、GSK-3によってGrb14の機能は調節されている可能性が高いことを示唆する複数のエビデンスが得られたため、これらについて論文を投稿し、アクセプトされた。
Grb14がインスリン受容体の機能を抑制するにあたって、どの様な因子に調節を受けているかという点に関して、未だその全容は謎である。Grb14に直接的に相互作用するタンパク質を網羅的・効率的に同定することで、全容解明に向けた足掛かりが得られることが期待できる。そこで次年度は、酵母ツーハイブリッドによる、ヒトnormalized cDNAライブラリ、および、ヒト肝臓cDNAライブラリ中から、Grb14に結合するタンパク質を探索する。併せて、肝由来細胞株であるHepG2をもとに、Grb14の安定発現株を構築し、細胞内のGrb14のプルダウンアッセイを行う。プルダウンされたGrb14のリン酸化状態、および共沈してきた因子（タンパク質）を、質量分析計を用いて、プロテオミクス的に解析する。
想定していた仮設と異なる実験結果が得られたため、研究内容を若干修正し、それに係る機材購入のために30万円の前倒し支払い請求を行ったが、当該の機材購入にあたり、値引きが行われたため、その額に残が生じた。
前倒し請求をおこなったことにより、結果的に次年度の予算は当初計画よりも若干少なくなっている。この点に留意しつつ、平成29年度は当初の計画通り予算を執行する予定である。
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J. Biochemistry
巻: 印刷中 ページ: 印刷中
10.1093/jb/mvx007
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www.bio.kyutech.ac.jp/~sakakan/
