| 研究課題/領域番号 |
16K21229
|
|---|
| 研究機関 | 佐賀大学 |
|---|
研究代表者 |
倉田 里穂 佐賀大学, 医学部, 助教 (70711729)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
|
| キーワード | 炎症応答 / ベーチェット病 / TRIM / インターフェロン |
|---|
| 研究実績の概要 |
べーチェット病は、口腔粘膜や外陰部の潰瘍および皮膚やぶどう膜の炎症を主症状とする全身性の炎症性疾患である。全身性の疾患でありながら特定の臓器に症状が現れる傾向が強く、特殊な病態を示す。ぶどう膜炎による失明や度重なる炎症症状は患者のQual ity of life(QOL)を著しく低下させることから、新規治療法は社会的にも要求性かが高い。免疫応答としてはインターフェロン(IFN) を中心としたTh1型と考えられていたが、自己免疫疾患に深く関与するTh17がベーチェット病の病態に関与することが明らかになりつつある。ベーチェット病について、これまでに数多くの遺伝子関連解析が行われ、ヒト主要組織適合遺伝子複合体のHLA-B*51、HLA-A*26やインターロイキンのIL-10、IL23R-IL12RB2への感受性が報告されている。加えて、HLA領域のSNP関連解析により、新たにTRIM39Rに感受性を見出した。
TRIM39Rは、tripartite motif-containing 39(TRIM39)およびribonuclease P/mitochondrial RNAprocessing 21 kDa subunit(Rpp21)遺伝子間のインタージェニックスプライシングによって、mRNAから翻訳されるキメラタンパク質で、TRIM39のC末端に位置するSPRYドメインがRpp21の酵素活性ドメインに置き換わった分子構造をもつ。TRIM39、TRIM39RおよびRpp21の過剰発現系を、HEK293T細胞を用いて樹立し、マイクロアレイを用いた遺伝子発現網羅的解析により、TRIM39RのみがI型IFN応答を惹起することを見出している。
|
| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
・遺伝子改変マウスの作製：TRIM39RはTRIM39とRPP21のキメラ遺伝子で、遺伝子中の大部分の領域をTRIM39およびRPP 21と共有しているので、TRIM39R特異的に欠損させることが難しい。そのため、TRIM39RとTRIM39に共通のN末端側の領域を標的とし、TRIM39およびTRIM39Rの両方のタンパク質が欠損するようにデザインしたguide RNAを作製した。このguide RNAを用いて、TRIM39遺伝子改変マウスをC57BL/6およびBALB背景で作製し、ライン化に成功した。TRIM39R遺伝子導入マウス作製するために、CAGプロモーターを用いたDNA溶液を作製した。マウスRosa26遺伝子座に標的遺伝子を導入する実験系を検討中である。
・レポーターアッセイによるIFNの測定：分泌型アルカリホスファターゼを連結したエピソーマルベクター(NFkB-SEAPおよびIRF-SEAP) を培養細胞に導入し、レポーター遺伝子恒常発現株を樹立した。さらにTRIM39R、TRIM39およびRPP21を 過剰発現すると、TRIM39RのみかがIFNを惹起した。
・TRIM39の立体構造解析：TRIM39ではなくTRIM39RがIFNを惹起することが明らかになったが、両分子の違いはC末端側のドメイン構造にある。そこで、立体構造解析を行った。N末端のドメイン構造は、既にN末端構造が予測されているTRIM30を参考にし、C末端のドメインは既に予測されたRPP21の構造を用いた。その結果、RIG-Iと相互作用するTRIM25に酷似した立体構造をとることが分かった。さらに、HIV-1を直接認識するTRIM5αと同様に、二量体の構造をとることが予測された。
|
| 今後の研究の推進方策 |
今後はin vivoおよびin vitroでTRIM39Rの機能解析を進める。具体的には下記研究を進める。
・遺伝子導入マウスを作製する。
・遺伝子改変マウスのフェノタイプ解析を順次行う。
・TRIM39Rの各ドメイン(RING、B-box、Coiled-coil、PRYおよびRPR)欠損変異体をレポーター遺伝子恒常発現細胞に発現し、IFNの発現変動を分析する。
これと並行して、TRIM39Rの分子ターゲット探索を行う。TRIM39Rと相互作用するRNAを免疫沈降法により分離し、次世代シーケンサーを用いたRNAシークエンスによって同定する予定である。同定したRNAは、TRIM39R分子のRPRドメインの結合分子である可能性が高いため、TR IM39RおよびRPRドメイン欠損型TRIM39R(TRIM39RΔRPR)発現ベクターを用いて、相互作用を確認し、RPRドメインの結合分子を同定する。
|
