| 研究課題/領域番号 |
16K21278
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| 研究機関 | 静岡県立大学 |
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研究代表者 |
三崎 健太郎 静岡県立大学, 看護学部, 助教 (40468591)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 多環芳香族化合物 / アレルギー / サイトカイン / 抗原同時曝露 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、大気環境物質のアレルギー増悪作用において、それに大きく影響する多環芳香族化合物と責任構造式の探索を行い、またそれらに対して強く応答するシグナルや細胞等の追跡によって、作用機序を解明することを目指している。平成28年度は多環芳香族化合物と抗原との共曝露影響に注目して、ヒト肺胞上皮（A549）細胞を用いて炎症性サイトカイン（IL-8）産生を強く誘導する多環芳香族化合物をスクリーニングして、ダニ抗原（10 μg/mL）との併用曝露24時間でフェナレノン（PhO）、ベンゾピレノン（BPO）、1-ニトロピレン（1-NPy）で有意な減少が、無水ナフタル酸（NA）で増加傾向が認められていたが、当該年度はさらに対象化合物を増やして網羅的に調べるとともに、より顕著な活性増悪を示す条件を検討したところ、48時間の共曝露において、ナフタセンキノン（NCQ）、NAに関してIL-8産生の顕著な増大が見出された。酸無水物は炎症を引き起こす物質として知られているため、これらの化合物のアレルギー増悪への部分的寄与が予想される。より長時間曝露の条件で、他のサイトカイン、ケモカインの産生についても測定し、芳香族炭化水素レセプター（AhR）活性や抗酸化応答、NF-κB等の各種シグナル伝達との関連性の評価を進めている。
一方、都市大気汚染粒子および自動車排出微粒子（100 μg/mL）、各種大気浮遊粒子成分（炭素、SiO2、TiO2、Fe2O3）（200 μg/cm2）を対象として、A549細胞において24時間曝露させたところ、SiO2において顕著な増大が認められたが他の粒子ではこれまでのところ影響は認められなかった。また、ダニ抗原（10 μg/mL）とSiO2の24時間、同時曝露においてはダニ抗原単独曝露に比べてIL-8産生が減少した。増悪活性が認められる曝露条件をさらに検討しているところである。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
4: 遅れている
理由
十数種類の代表的な多環芳香族化合物類（PAHsやoxy-PAHs、nitro-PAHs）を対象として、ヒト肺胞上皮（A549）細胞における炎症サイトカインの変動についてタンパク質レベルで評価を行って、その増大が顕著に認められる曝露条件（ダニ抗原との同時曝露48時間）を当該年度に新たに見出すことができた。また、その他の各種ILs、CCLs、ICAM-1などを評価対象として、mRNAレベル、タンパク質レベルでの評価を進めているところである。また、A549細胞に対して、粒子や粒子と抗原の同時曝露によるサイトカイン産生についても調べてきた。
ヒト急性T細胞性白血病由来（Jurkat）細胞に対して、分化刺激（PMAやionomycin）の存在・非存在下での各種多環芳香族化合物への曝露における、各種サイトカイン（IFN-γ、IL-4、IL-17、TGF-βなど）誘導への影響評価についても開始している。
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| 今後の研究の推進方策 |
各細胞、特にJurkat細胞の増殖や分化能、サイトカイン、表面マーカー、転写因子の遺伝子やタンパク質レベルでの発現変化に対してRT-PCRやELISA、フローサイトメトリー等による評価を進めていくが、フローサイトメトリーなどについては他機関での測定を予定している。シグナル経路として、AhR活性、抗酸化応答との関連性を、各シグナル伝達の阻害剤との共曝露による発現変化によって評価する。また、AhR活性との関連性が指摘されているTh17、Treg細胞における各種遺伝子、タンパク質誘導への多環芳香族化合物の影響を調べるため、RORγtやFoxp3の遺伝子を導入したJurkat細胞をその評価に用いて、活性化合物や活性曝露条件を調べ、各種シグナル経路との関連性を考察する。大気試料抽出物については、高いアレルギー活性を示す分画を探索し、含有成分との関連を調べ、同様に各種シグナル経路との相関解析を実施する。
In vitro系において十分な知見を得るように実験を進め、その結果、特に強く活性が見出された化合物については、成体マウスに対して多環芳香族化合物単独で、あるいは抗原との共曝露によって気管内投与した場合における、気管支肺胞洗浄液中の血球細胞の数や種類、サイトカイン、ケモカイン、抗体産生、各種遺伝子発現等をフローサイトメトリーや細胞染色、ELISA等によって測定する。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
年度末に購入予定だった消耗品（細胞）について実験に要する時期が遅れたため、翌年度に購入するように変更を行った。
平成30年度は核、顆粒レベルで細胞の詳細が観察でき、分化の状態も丁寧に追跡できるように位相差顕微鏡の導入を予定している。また、AhR活性との関連性が指摘されているTh17、Treg細胞における各種遺伝子、タンパク質誘導への多環芳香族化合物の影響を調べるため、RORγtやFoxp3の遺伝子を導入したJurkat細胞の購入も検討している。in vitro系における十分な知見を基にして、マウスなど実際の生体における作用機序への適用を目指している。
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