| 研究課題/領域番号 |
16K21289
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
西野 有里 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 助教 (20342826)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | 微結晶 / 標識 / 金属結合タグ / メタロチオネイン / 分子内運動 |
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| 研究実績の概要 |
マウスalpha7型アセチルコリン受容体（nAChR）のC末端に、フィトケラチンのalphaペプチドアナログとメタロチオネインを金属結合ペプチドタグとして融合するための遺伝子コンストラクトを作製した。また、タンパク質の検出や精製に利用するために、コンストラクトにはさらにFLAGタグを連結させた。また、nAChRの異種細胞発現系でのフォールディングを促進させるために、alpha7型nAChRのシャペロンタンパク質として知られているric-3をIRES配列を介してnAChRと連結させ、nAChRと同一プロモーターで発現できるようにした。金属結合タグ融合alpha7型nAChRは、マウス神経芽細胞腫とラットグリオーマ細胞由来の哺乳類培養細胞であるNG108-15細胞で発現検討を行った。カチオニックリポソームを利用した一過性発現系では十分な発現効率が得られなかったが、レトロウィルスを用いて安定発現系を作製することによって、効率良く金属結合タグ融合alpha7型nAChRを発現させることができた。また、nAChRのリガンド結合能を調べることにより、機能を持ち合わせた受容体として発現していることを確認できた。
また、並行して、この金属結合ペプチドタグによって生体内で形成される金属微結晶を利用して、目的タンパク質が生体内に存在した状態でX線一分子追跡法（DXT）による分子内運動計測が可能であるかどうか、フィトケラチンのalphaペプチドアナログとメタロチオネインを連結させた金属結合ペプチドタグを用いてカドミウムとセレンの微結晶、および金の微結晶を形成させて分子内運動計測の検証を行っている。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
予定通り、alpha7型nAChRに金属結合ペプチドタグを融合させて、機能を持った状態で細胞で発現させることができた。当初はアフリカツメガエル卵母細胞を用いる予定であったが、より本来、生体でalpha7型nAChRが存在している状態に近い神経由来の哺乳類培養細胞で発現させることができた。また、金属結合ペプチドタグ上で形成させた金属微結晶を利用した分子内運動については現在技術的な検証を進めている。
これらのことからおおむね順調に進んでいると考えられる。
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| 今後の研究の推進方策 |
金属結合ペプチドタグ上で形成させた微結晶を利用した分子内運動計測を続け、よりDXT計測に適した、大きな結晶性が良くX線回折の生じやすい金属微結晶を形成させるために、用いる金属種やタグの改良を進める。細胞培養液に添加する金属イオン濃度を上昇させると形成される金属微結晶が大きくなることが報告されているが、細胞毒性が生じやすくなる。そこで、金属イオンの添加濃度だけでなく、添加時間についても検討を行う。また、フィトケラチンはグルタミン酸とシステインの繰り返し配列であり、遺伝子的には繰り返し数を無限に増やすことが可能である。繰り返し数を増やすことによって金属微結晶を大きくできることが期待される。しかし、大きなタグを融合させるとタンパク質のフォールディングや機能に影響を及ぼす可能性があるので、慎重にタンパク質の状態を調べながら最適な繰り返し数について検討を行う。金属微結晶の形成状態の評価は、初期検討段階では、透過型電子顕微鏡で観察を行うことによって行い、最終的にはDXT計測を行って判断する。
また、金属結合ペプチドタグ融合alpha7型nAChRの高精度な精製法の検討を行い、各リガンド存在下での単粒子解析を行う。アフリカツメガエル卵母細胞を用いて金属結合ペプチドタグ融合alpha7型nAChRを発現させてカラム精製することを当初は想定していたが、昨年度、大腸菌を用いて機能を持ち合わせた哺乳類のalpha7型nAChRを発現、精製できたという報告があった。大腸菌を用いる方が短時間でより大量に調製できる可能性が高いことから、大腸菌を用いた精製についても検討を行う。
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