| 研究課題/領域番号 |
16K21317
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| 研究機関 | 自治医科大学 |
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研究代表者 |
山室 大介 自治医科大学, 医学部, リサーチ・レジデント (20739255)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 24S-ヒドロキシコレステロール / アルツハイマー型認知症 / NCEH1 / ACAT1 |
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| 研究実績の概要 |
アルツハイマー型認知症(AD)の原因因子とされる脳内アミロイドβの沈着がコレステロール酸化代謝物のひとつである24S-ヒドロキシコレステロール(24S-HC) の脳内増加によって抑制される可能性が報告されてきた。その中、NCEH1欠損マウスの脳では野生型マウス脳に比べて24S-HCが有意に増加していた。そこで、NCEH1が脳内24S-HC量を規定することにより脳内アミロイドβの沈着を制御する可能性を検討した。アミロイドβ沈着やタウ蛋白の過剰なリン酸化による神経細胞死はAD発症の一因となるが、脳内24S-HCも神経細胞死を誘発する。そこで細胞実験ではACAT1阻害剤およびNCEH1阻害剤と24S-HCをSH-SY5Y細胞に作用させ、TUNEL染色法及びMTT assay にて細胞死を評価した。その結果、ACAT1 阻害剤では24S-HCが誘発する細胞死を有意に抑制した。また、細胞内24S-HC含量をLC-MS/MSを用いて測定した結果、 ACAT1阻害剤添加ではfree体が、NCEH1阻害剤添加ではester体が有意に増加した。次いでACAT1阻害剤及びNCEH1阻害剤の24S-HC添加時におけるAPP産生タンパク(APP、ADAM10、BACE-1、PS-1)への影響をwestern-blotting 法にて評価した結果、24S-HC添加時に見られたAPPタンパクの発現増加は阻害剤添加では影響を与えなかった。さらに、ELISA 法にてAβ分泌への影響を評価した結果、24S-HC 添加時に見られたAβ1-40及びAβ1-42 分泌低下はACAT1阻害剤でのみ抑制された。
動物実験ではNCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスを樹立した。本マウス(10ヶ月齢)の脳切片を作製し、免疫組織化学染色法にてAβ oligomer の蓄積を現在評価している。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の研究計画ではADモデルマウス(3XTg-ADマウス)とNCEH1欠損マウスを交配させ、NCEH1欠損ADモデルマウスを初年度に樹立する予定だったが、交配マウスの 作成期間短縮を目的に、他のADモデルマウス (APP oligomer Tgマウス)を交配に使用する計画にした。APP oligomer Tgマウス導入にあたり、凍結精子からの受精胚作成・移植を行ったが、着床は認められたが妊娠の維持がされず、胚盤胞期までの発生状態を確認し、再度IVFによる受精胚の生産後、胚移植と凍結保存を行い、個体作成を行った為に動物実験に遅延が生じた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ADモデルマウスの個体作成に遅延が生じ、その解析も延期されたため、次年度使用額が生じた。
NCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスに関して、大脳皮質や脳海馬におけるAβ oligomer 沈着を抗Aβ oligomer 抗体による免疫組織化学染色法にて評価中である。また、既に採取した脳組織を用いてAD疾患の原因分子をELISA kit、western-blottingや real-time PCRなどの生化学的手法を用いて解析し、動物レベルでのNCEH1のAD発症機序への関与を明らかとする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
ADモデルマウスの個体作成に遅延が生じ、その解析も延期されたため、次年度使用額が生じた。
NCEH1欠損APP oligomer 過剰発現マウスに関して、脳海馬におけるAβ oligomer 沈着を抗Aβ oligomer 抗体による免疫組織化学染色法にて評価する。また、 AD疾患の原因分子をELISA kit、western-blottingや real-time PCRなどの生化学的手法を用いて解析し、動物レベルでのNCEH1のAD発症への関与を明らかとする。
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