| 研究課題/領域番号 |
16K21458
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| 研究機関 | 藤田保健衛生大学 |
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研究代表者 |
下條 尚志 藤田保健衛生大学, 医学部, 客員講師 (70410751)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | ハイブリッドペプチド / 魚アレルギー / 免疫療法 / T細胞エピトープ |
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| 研究実績の概要 |
本研究は魚アレルギー免疫療法の基盤的研究として、魚抗原由来ペプチドを特定し、魚アレルギーマウスに投与することで免疫寛容を成立させる画期的な治療薬創製の可能性を探求するものである。本年度は、アレルギーマウスの作製法の確立、原因抗原の特定と作製に主眼を置き研究を行った。
魚アレルギーマウスの作製：遺伝子の登録数やアレルギー患者が比較的多い鮭を用いて実験を遂行した。鮭身から得られた粗抽出物とアジュバンド（水酸化アルミニウム）を腹腔内投与し、能動的に感作させた。感作状態を確認した結果、血清IgE量は有意に上昇していた。WST-1による鮭粗抽出物を用いた脾臓細胞増殖試験の結果、著しく細胞が増殖した。細胞培養した上清中のサイトカイン産生量を測定した結果、IL-13やIFN-γが有意に上昇した。以上の結果より、魚アレルギーマウス作製に成功した。
魚主要抗原の作製：魚の主要アレルゲン4種（パルブアルブミン、アルドラーゼ、エノラーゼ、GAPDH）の遺伝子を受託合成し、pETベクターシステムに挿入して大腸菌の発現系を用いて蛋白質を合成した。今後、これら蛋白質を用いて血清中IgEとの結合実験を試みる。
質量分析装置を用いたMHCに提示された抗原ペプチドの特定：実験の進行状況はやや遅れている。来年度以降に対応する予定である。ペプチド合成：ペプチド合成機（Intavis社）を新たに導入した。鮭パルブアルブミン配列をもとに、全配列を網羅したペプチドを作製することに成功した。今後は任意の抗原ペプチドを合成する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
魚アレルギーマウスの作製、抗原作製に関する実験系の確立がなされ、かつ、エピトープ免疫療法に用いるペプチドの合成システムが確立されたことは、当該研究の土台構築という観点から重要な達成点であった。以上の次第であり、これまでの研究進捗はおおむね良好であると言うべきである。ただ一方で、MHC提示ペプチドの単離法については遅れている状況であり、その遅れを取り戻すために来年度に向けて方法論を確立する。特に、マウス末梢血単核球からの樹状細胞化、貪食実験・ペプチド提示の高効率化、MHC提示ペプチドの単離、質量分析装置の測定条件等、を行う予定である。
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| 今後の研究の推進方策 |
来年度について、合成した主要抗原の中から原因抗原を特定する。もし主要抗原が原因抗原でなかった場合には、鮭粗抽出物とマウス血清を用いたウエスタンブロッティングを実施し、血清中IgEがどの抗原と結合しているかを確認予定である。
アレルギーマウスから単離した細胞と合成ペプチドを反応させるin vitro実験が研究の首座を占める可能性が高い。その間の動物実験は感作条件についてさらなる最適化を行い、アレルギーマウスを作製することで再来年度予定の免疫寛容候補ペプチドの投与実験に備える。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
試薬・消耗品が当初の見込みより安価に購入できたから。
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| 次年度使用額の使用計画 |
来年度以降の試薬・消耗品の購入に充当する予定である。
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