| 研究課題/領域番号 |
16K21524
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| 研究機関 | 兵庫医科大学 |
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研究代表者 |
下村 英毅 兵庫医科大学, 医学部, 助教 (30441273)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 筋ジストロフィー / スプライシング異常 / アンチセンスオリゴヌクレオチド / エクソンスキッピング |
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| 研究実績の概要 |
現在、Duchenne型／Becker型筋ジストロフィー（DMD/BMD）のスプライシング促進配列（Exonic splicing enhancer: ESE）に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（AS-oligo）によりエクソンのスキッピングを誘導する治療法の治験が世界各地で行われている。しかし、DMDでみられる遺伝子変異は多彩であり、症例ごとにスキッピングを誘導する標的エクソンが異なるため、多くの症例に本治療を適応するためには、ジストロフィン遺伝子内のESEを広く同定する必要がある。
平成30年度は、前年度に引き続きMLPA法によって欠失・重複変異が同定されなかった筋ジストロフィーの症例に対し、直接塩基配列解析法あるいは次世代シークエンサーにより点変異、1ないし数塩基の欠失・重複変異などの微小変異の同定を行い、症例の蓄積を行った。該当症例において、mRNAの解析を行い、新規スプライシング変異を同定した。また、Ullrich型筋ジストロフィーに関しても、同一アレルに近接した2か所の変異を同定し、mRNAの解析によりスプライシングパターンを解析した。
次年度以降は、mRNA、スプライシングの解析をさらに進め、スプライシングに影響する微小変異をカバーする約20塩基のAS-oligoを複数デザインする。そして、１ないし数エクソンの欠失を有する筋ジストロフィー症例の筋培養細胞にAS-oligoを添加し、mRNAにおけるスプライシングおよび蛋白の発現を解析する予定である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
平成30年度は、MLPA法によって欠失・重複変異が同定されなかった筋ジストロフィーの症例に対し、直接塩基配列解析法あるいは次世代シークエンサーにより点変異、1ないし数塩基の欠失・重複変異などの微小変異の同定を行った。該当症例において、mRNAの解析、およびスプライシング異常の同定を行った。解析は進んでいるが、症例の蓄積に想定より時間を要している。
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| 今後の研究の推進方策 |
前年度に引き続き、筋ジストロフィー症例遺伝子のゲノム・mRNAの解析を行い、mRNAでみられたスプライシング型よりESEの候補配列を同定していく。筋ジストロフィー症例においてエクソンスキッピングを誘導している微小変異周辺を含む20塩基前後のAS-oligoを、数塩基ずつずらした形で複数デザインする。AS-oligoは修飾核酸である2'-O,4'-C- ethylene-bridged nucleic acid (ENA) /RNAキメラオリゴを用いる。ENA/RNAキメラオリゴは、通常のオリゴヌクレオチドに比べ、40倍有効であることが明らかにされている。筋培養細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、48時間培養したのち、RNAを抽出する。RT-PCR法によりmRNAを解析し、エクソンスキッピング誘導の検討を行う。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
症例の蓄積に想定以上の時間がかかっており、解析頻度が少なかったため次年度使用額が生じた。次年度は症例の蓄積に伴い、解析頻度の増加を計画している。
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