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ミトコンドリアは、核内のゲノムDNAとは異なる独自の環状DNA(ミトコンドリアDNA; mtDNA)を持ち、正常なエネルギー代謝に必須な役割を果たしている。mtDNAの異常は様々な病気との関連が示唆されているが、その詳細な機構は不明な点が多い。特に生細胞内において、mtDNAの構造やコピー数を解析するための手法は未だ限られており、本課題の解決を妨げている原因の一端と考えられる。そこで本研究では、DNAの構造を鮮明に可視化・定量するためのライブイメージングツールを作成することで、本課題に切り込むことを目指した。
前年度は、細菌由来のDNA結合蛋白質に変異を導入することで、新規高親和性DNA構造可視化プローブのプロトタイプを作成することに成功した。今年度は、まずDNA結合領域に様々な変異を導入し、親和性の異なる様々な変異体の作成を試みた。光褪色後蛍光回復法による解析により、DNAに対する結合解離特性を持つプローブを作成できていることが判明した。特に、本プローブの中でDNAに対する親和性が高く、細胞内に導入した際にゲノム構造を最も鮮明に可視化できる変異体を、我々はChrocodiLEと命名した。マーカー染色による評価などから、ChrocodiLEは、ほどけた領域に選択的に結合する性質を持っていることが分かった。ChrocodiLEを用いることで、生細胞内でのゲノム構造変化をライブイメージングにより追従することに成功した。また、ChrocodiLEをミトコンドリア内腔に局在化させたが、mtDNAとの共局在は見られなかった。ChrocodiLEがゲノムDNAに強く結合するのに対し、mtDNAへの結合が見られないのは予想に反する驚くべき結果である。今後、ChrocodiLEにさらなる変異を導入し、mtDNAへの局在化の機構を解明し、本プローブの完成を目指す予定である。
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