| 研究課題/領域番号 |
16K21650
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
鈴木 元治郎 公益財団法人東京都医学総合研究所, 認知症・高次脳機能研究分野, 主席研究員 (60466034)
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| 研究期間 (年度) |
2016-04-01 – 2019-03-31
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| キーワード | TDP-43 / 筋委縮性側索硬化症 / プリオン |
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| 研究実績の概要 |
リン酸化TDP-43の細胞質における凝集体形成は、孤発性および家族性ALSで広くみられる病変であることから、ALSでみられる神経変性の原因である可能性が高いと考えられる。しかし、核に局在するタンパク質であるTDP-43がどのようなきっかけで細胞質へと移行するか？細胞質でどのようにして凝集体を形成するか？凝集体の除去は行われているのか？など多くの疑問点が残されている。そこで、TDP-43の細胞内挙動を詳細に解析し、これらの疑問点を明らかにすることを本研究の目的とする。
ヒト神経線維芽細胞SH-SY5Y細胞株においてN末端側にGFPを融合したTDP-43タンパク質を発現するノックイン細胞株をゲノム編集技術を利用して作製した。また、N末端側にGFPを融合したTDP-43タンパク質を安定的に高発現するSH-SY5Y細胞株を作製した。大腸菌を利用して全長のTDP-43タンパク質を非変性条件で発現・精製し、さまざまな条件下で凝集体の形成を促進させることによって、様々な構造をもったTDP-43タンパク質凝集体を形成することに成功した。形成したTDP-43タンパク質凝集体を蛍光色素によって標識し、TDP-43ノックイン細胞株などに導入し、導入した細胞内のTDP-43の挙動とゲノムから発現しているGFP-TDP-43の挙動をタイムラプス顕微鏡を利用して継時的に解析した結果、導入したTDP-43凝集体がシードとなり細胞で発現しているTDP-43タンパク質の凝集体を形成する過程を経時的に観察した。また、生化学的手法によってもTDP-43タンパク質の凝集体の形成と異常リン酸化TDP-43タンパク質の蓄積を観察した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
ヒト神経線維芽細胞SH-SY5Y細胞株においてN末端側にGFPを融合したTDP-43可視化細胞株をゲノム編集技術を利用して作製することに成功した。また、大腸菌によってTDP-43タンパク質を非変性条件で発現・精製する系を確立し、構造の異なる凝集体を形成することに成功した。これらの凝集体をSH-SY5Y細胞株に導入することによって細胞より発現しているTDP-43タンパク質の凝集化と異常リン酸化が促進されることを明らかにした。
しかし、並行している研究へのエフォートが高くなったことや凝集体の細胞内形成が困難であったことなどから当初の計画より進捗が少し遅れている。
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| 今後の研究の推進方策 |
TDP-43 タンパク質の細胞内における凝集体形成がどこで起こっているかを、各種細胞内小器官のマーカーとTDP-43 タンパク質の共局在を顕微鏡で観察することによって明らかにする。また、凝集体形成の阻害や凝集体の分解にオートファジー、プロテアソームなどが関与しているかを阻害剤を用いた解析により明らかにする。また、凝集体形成を誘導するTDP-43シードの構造の違いなどで凝集体形成過程は変化するか？TDP-43シードの構造の違いによって細胞に対する毒性が変化するか？を検討し、凝集体の構造と毒性の関係性を明らかにする。以上により、細胞内でTDP-43が凝集体を形成する過程とそれに伴う細胞毒性について明らかにする。
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| 次年度使用額が生じた理由 |
並行して行っている研究課題について他財団の研究費を獲得することができたため、共通して使用する試薬等の使用額が減少した。また、予定していた海外での研究発表を行うことが家庭の事情により困難になったこと、や国内旅費を他の研究費によって賄ったため旅費の支出が減少した。予定していた論文投稿料などのその他支出も論文投稿に至らなかったため減少した。以上の理由により次年度使用額が生じた。今年度は消耗品や物品等の購入を早い時期から行うことや、学会へ積極的に参加し知見を深める、論文を発表することにより掲載費を支出するなどにより研究費を計画的に使用することを心掛ける。
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