発癌性チロシンキナーゼによる腫瘍発生機構の解明

2019 年度 実施状況報告書

• 研究課題/領域番号: 16K21746
• 研究機関: 国立研究開発法人国立がん研究センター
• 研究代表者: 小林 進 国立研究開発法人国立がん研究センター, 先端医療開発センター, 分野長
• 研究期間 (年度): 2018 – 2020
• キーワード: 肺がん / EGFR / チロシンキナーゼ / β-catenin / チロシンキナーゼ阻害薬

研究実績の概要

EGFR遺伝子活性型変異を伴う非小細胞肺癌に対して、現在までに第3世代までのEGFRチロシンキナーゼ阻害薬(TKI)が承認され、予後も劇的に改善されている。しかし、一度縮小した腫瘍は2年ほどで耐性を示すようになり、完全治癒はいまだ達成されていない。この耐性機序の解明には活性型EGFRの発がんにおける役割を理解することが重要である。我々は、初年度の東北大学大学院歯学研究科・先端再生医学研究センターの犬塚博之准教授との共同研究により、活性型EGFRによるβ-cateninの4箇所(Y142, Y670, Y716、Y748)のチロシンリン酸化がその核移行とタンパク安定性に関与していることを示した。令和元年度は、β-cateninの別のチロシン残基であるY333が別のチロシンキナーゼであるSRCによってリン酸化され、興味深いことにEGFR-TKI阻害剤存在下ではそのリン酸化が増強されていることを見出した。Y333のリン酸化の増強によってβ-cateninはTBX5と結合し、抗アポトーシスたんぱくであるBCL-XLを増強させた。この機構が、Drug-Tolerant Persiser (DTP)細胞の形成に重要であり、キナーゼ耐性に重要であることを示した。このDTP細胞の出現を抑制することでEGFR-TKI阻害剤耐性を制御できる可能性を示す。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

今年度(令和元年度)では、交付申請書に記載した当該年度の実験計画をほぼ終了し、活性型EGFR及びSrcによるβ-cateninのリン酸化の役割を解明できたと考えている。東北大学大学院の犬塚博之准教授との共同研究も大変順調であった。

今後の研究の推進方策

3年度目は、EGFR-TKI存在下においてSRCによるβ-catenin-Y333のリン酸化機構及びその生物学的役割を検討する。具体的には、まずβ-catenin-Y333F変異体を作成し、TBX5との結合能、TBX5の転写活性の上昇とBCL2L1の発現変化を共免疫沈降法、ルシフェラーゼアッセイ、リアルタイムPCR法にて検討する。また、肺がん細胞(H1975およびPC9)細胞を用いてCRISPR-CAS9を用いてβ-catenin-Y333Fノックイン細胞を作成し、DTP細胞産生能と第3世代EGFR-TKI阻害薬であるosimertinibに対する耐性細胞の出現率を野生型細胞と比較する。さらに、野生型H1975細胞と、β-cateninチロシン変異H1975細胞を用いて、RNAシークエンスおよび2種類の抗体(TBX5およびH3K27ac)を用いたクロマチン免疫沈降シークエンス(ChIP-Seq)を行う。これら3つのデータを比較検討することで、β-cateninのチロシンリン酸化によって活性能の上昇したTBX5下流の標的遺伝子を同定する。最後に、活性化型β-cateninを発現するマウス(Ctnnbl^<ex3>)と変異型EGFR発現マウスを掛け合わせ、osimertinibで治療することによって活性化型β-cateninがosimertinibに対する耐性発現に寄与していることを検討する。研究の最終年度に当たり、論文化及び出版を目指す。

次年度使用額が生じた理由

昨年度中にマウスを使用した実験の開始を計画していたが、特任研究補助員が一人退職したため、動物実験のための研究費が使用されずに繰越となった。令和2年4月より新たな研究補助員が加わり、次年度に上記動物実験に使用する予定である。

研究成果

• [国際共同研究] Beth Israel Deaconess Medical Center/New York University(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Beth Israel Deaconess Medical Center/New York University
• [国際共同研究] National University of Singapore(シンガポール)
  • 国名: シンガポール
  • 外国機関名: National University of Singapore
• [雑誌論文] Molecular dynamics simulation-guided drug sensitivity prediction for lung cancer with rare EGFR mutations (2019)
  • 著者名/発表者名: Ikemura S, Yasuda H, Matsumoto S, Kamada M, Hamamoto J, Masuzawa K, Kobayashi K, Manabe T, Arai D, Nakachi I, Kawada I, Ishioka K, Nakamura M, Namkoong H, Naoki K, Ono F, Araki M, Kanada R, Ma B, Hayashi Y, Mimaki S, Yoh K, Kobayashi SS, Kohno T, Okuno Y, Goto K, Tsuchihara K, Soejima K
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 巻: 116 ページ: 10025-10030
  • DOI: 10.1073/pnas.1819430116
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Styryl quinazolinones and its ethynyl derivatives induce myeloid differentiation (2019)
  • 著者名/発表者名: Radhakrishnan S, Syed R, Takei H, Kobayashi IS, Nakamura E, Sultana F, Kamal A, Tenen DG, Kobayashi SS.
  • 雑誌名: Bioorg Med Chem Lett. 巻: 29 ページ: 2286-2289
  • DOI: 10.1016/j.bmcl.2019.06.024
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Brief Report : EGFR-mutated lung cancers resistant to osimertinib through EGFR-C797S respond to 1st generation reversible EGFR inhibitors but eventually acquire EGFR-T790M/C797S in preclinical models and clinical samples (2019)
  • 著者名/発表者名: Rangachari D, To C, Shpilsky JE, VanderLaan PA, Kobayashi SS, Mushajiang M, Lau CJ, Paweletz CP, Oxnard GR, Jänne PA, Costa DB
  • 雑誌名: J Thorac Oncol. 巻: 14 ページ: 1995-2002
  • DOI: 10.1016/j.jtho.2019.07.016
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] TAS6417/CLN-081 is a pan-mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitor with a broad spectrum of preclinical activity against clinically-relevant EGFR mutations (2019)
  • 著者名/発表者名: Udagawa H, Hasako S, Ohashi A, Fujioka R, Hakozaki Y, Shibuya M, Abe N, Komori T, Haruma T, Terasaka T, Fujita R, Hashimoto A, Funabashi K, Yasuda H, Miyadera K, Goto K, Costa DB, and Kobayashi SS
  • 雑誌名: Molecular Cancer Research 巻: 17 ページ: 2233-2243
  • DOI: 10.1158/1541-7786.MCR-19-0419
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Effects of gefitinib treatment on cellular uptake of extracellular vesicles in EGFR-mutant non-small cell lung cancer cells (2019)
  • 著者名/発表者名: Takenaka T, Nakai S, Katayama M, Hirano M, Ueno N, Noguchi K, Takatani-Nakase T, Fujii I, Kobayashi SS‡, Nakase I‡
  • 雑誌名: Int J Pharm. 巻: 17 ページ: 118762
  • DOI: 10.1016/j.ijpharm.2019.118762
  • 査読あり / 国際共著
• [学会発表] Multiple modalities of single cell analyses to evaluate the tumor microenvironment in clinical specimens (2019)
  • 著者名/発表者名: Yukie Kashima, Shota Fukuoka, Yosuke Togashi, Takahiro Kamada, Ayako Suzuki, Yoshiaki Nakamura, Kohei Shitara, Akihiro Ohashi, Taku Yoshida, Naofumi Taoka, Tatsuya Kawase, Teiji Wada, Kocihiro Inaki, Masataka Chihara, Yutaka Suzuki, Katsuya Tsuchihara, Susumu S Kobayashi, Hiroyoshi Nishikawa, Toshihiko Doi.
  • 学会等名: AACR-NCI-EORTC International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics
  • 国際学会
• [学会発表] Met/Rorl-β-catenin-Bcl-xL axis contributes to the emergence of drug-tolerant cells that evolve into resistant tumors in EGFR-mutant lung cancer (2019)
  • 著者名/発表者名: Masanori Fujii, Sohei Nakayama, Naoki Akanuma, Gilbert Pan, Ikei S. Kobayashi, Hisashi Takei, Kohei Shimizu, Mariko Ando, Eunyoung Heo, Carol Gergis, Hiroyuki Inuzuka, Wenyi Wei, Daniel B. Costa, and Susumu S. Kobayashi
  • 学会等名: AACR Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] Preclinical evaluation of TAS6417 as a highly effective, pan-mutation-selective EGFR tyrosine kinase inhibitor (2019)
  • 著者名/発表者名: Hibiki Udagawa, Shinichi Hasako, Akihiro Ohashi, Naomi Abe, Tomonori Haruma, Toshiharu Komori, Miki Terasaka, Ryoto Fujita, Kaoru Funabashi, Hiroyuki Yasuda, Kazutaka Miyadera, Koichi Goto, Daniel B. Costa and Susumu S. Kobayashi
  • 学会等名: AACR Annual Meeting
  • 国際学会
• [学会発表] 治療抵抗性腫瘍の治療開発 (2019)
  • 著者名/発表者名: 小林 進
  • 学会等名: 日本臨床腫瘍学会
  • 招待講演
• [学会発表] Tumor Heterogeneity and Implications to Treatment Strategy with EGFR TKIs (2019)
  • 著者名/発表者名: 小林 進
  • 学会等名: 日本肺癌学会北海道支部会
  • 招待講演
• [備考] 申請者のホームページ
  • URL: https://www.ncc.go.jp/jp/epoc/division/translational_genomics/kashiwa/index.html