|
核酸鋳型化学反応では、2種類のオリゴ核酸鎖の末端に化学反応性の官能基を導入したプローブを用いる。これらが配列特異的に標的RNAに結合し局所濃度が高まることで発蛍光反応が進行する。標的核酸鋳型を触媒として利用し反応回転を起こすことによりシグナル増幅が可能になるが、反応サイクルにおける結合・化学反応・解離の各ステップを高速化することで、高感度な核酸検出が可能になる。
前年度までに反応サイクルにおける化学反応のステップの高速化の検討を行い、反応性官能基をチオフェノール基からセレノフェノール基に変更することで、発蛍光反応の高速化に成功した。この成果を踏まえ、本研究では最終目標である細胞内での高感度のRNA検出の検討を行った。細胞内RNA検出においては、適切な手法でプローブを細胞内に入れることが重要である。例えばオリゴ核酸の細胞内導入法として一般的なリポフェクション法を用いた場合、プローブが細胞内で凝集するため正確かつ高感度な検出の障害となる。そこで本研究では大腸菌をモデルとして、RNA検出プローブ検出に適した細胞導入法の検討を行った。その中でホスホロチオエート修飾を導入した核酸プローブが最適であることを見出した。リポフェクション試薬等を用いずに細胞にプローブを投与し標的であるrRNAの検出に成功した。今後は、プローブ核酸にさらなる修飾を導入することにより、標的RNAの結合・乖離を促進し、検出感度の一層の向上を目指す予定である。
|
