研究実績の概要 |
細胞は細胞外からの刺激入力がなくても自発的に運動する。細胞内では前後極性のシグナルが自発的に生成しており、このメカニズムを理解することは生物が利用する自己組織化の原理の理解に繋がる。本研究課題では、前側シグナルであるイノシトールリン脂質PI(3,4,5)P3の代謝系において、自発的シグナル生成に最低限必要な分子反応ネットワークの構成分子種を明らかにすることを目的として、ダイナミクスをリポソーム内で再現する再構成実験を行う。本年度は、このネットワークにおいて中心的な役割を果たすことがすでに分かっているPI(3,4,5)P3代謝酵素PI3KおよびPTENについて、これらのリコンビナントタンパク質をそれぞれ活性のある状態で精製しリポソーム内に封入することに成功した。3'リン酸化酵素PI3Kの基質であるPI(4,5)P2あるいは3'脱リン酸化酵素PTENの基質であるPI(3,4,5)P3を任意の組成で含むリポソームを作成した。PLCdeltaあるいはAkt/PKBのイノシトールリン脂質結合ドメインとGFPとの融合タンパク質を精製してこれらのリポソーム作成時に封入し、PI(4,5)P2あるいはPI(3,4,5)P3に対する蛍光プローブとしての特異性を確認した。さらに、精製した酵素のいずれかを追加してリポソームを作成した結果、リポソーム内でのPI3KあるいはPTENの活性をイメージングにより検出することができた。これらの基礎的技術を元に、今後はPI3KとPTENの同時封入による前後極性シグナルのダイナミクスの再現を目指す。
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