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認識・意識・感情・思考・運動企図などといった脳の高次機能は大脳皮質を中心とした神経回路により実現されていると考えられるが、これらの高次機能を可能にしている作動原理は未だに明らかにされていない。我々は大脳皮質の局所回路を解析する手段として、「From one to group」の研究方針を立て以下の研究を行った。(1)「GAD67/GFP knock-in mouseを用いて、蛍光顕微鏡下に生きたまま観察できるGABA作動性ニューロンをホールセルクランプにより細胞内染色する。」アダルトマウスでのホールセルクランプでの問題を、Sodium-freeの溶液でスライス作成によりほぼ解決したので、逆行性標識法との組み合わせにより、皮質GABA作動性インターニューロンから皮質脊髄投射ニューロンへの入力を解析している。(2)「dendritic membrane-targeted GFP transgenic mouse」lentivirusでは遺伝子がchromosomeに組み込まれ、感染細胞にとってトランスジェニック動物と同じ状況になることから、トランスジェニック動物での遺伝子発現・タンパク質局在に関して良いモデルとして使えると考え、lentivirusを用いて8種類のtagged GFPを試みた。その結果、ニューロンの樹上突起をGolgi染色様に標識できるtagged GFP([myristoylation/palmitoylation site of Fyn]-[GFP]-[LDL receptor C-terminus])を開発できた。Thy1 promoterとGAD67 promoter下にこのtagged GFPを発現するtransgenic mouseを作製しつつあり、Thy1 promoter transgenic mouseでは、GFPのdendritic membrane targetingに成功した。今回のtransgenic mouseでの成功を受けて、より発現特異性の高いparvalbumin promoterを用いたBAC transgenic mouseを作成中である。(3)「Pseudorabies virus等」palmitoylation GFP(palGFP)を強制発現するPseudorabies virusの作成に成功し、大脳皮質の投射ニューロンをGolgi染色様に逆行性標識することが可能になったが、標識効率が低いという問題があるので、pesudo-rabies virusの感染効率をさらに上げる工夫をしている。また、lentivirusのenvelope glycoproteinをVSV-Gから、rabies virus glycoprotein(RVG)に変えて、神経軸索に感染して逆行性標識が可能になるような試みもしている。さらに、palGFP adenovirusを用いた逆行性標識の試み(高塩濃度下に注入)も行なって一定の成功を得た。
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