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昨年度(17年度)は、マスト細胞におけるアクチン線維基盤とする分泌小胞の輸送機構ついて、研究を行った。本年度(18年度)は、より長距離の輸送を担うと考えられる微小管を基盤とした分泌小胞の輸送について検討を加えた。また、マスト細胞における分泌小胞と細胞膜の融合部位の特徴的な構造を明らかにすべく、アクティブゾーンタンパク質として重要な役割を果たすタンパク質であるELKSの発現と機能解析を行った。
(1)マスト細胞における微小管上の分泌小胞輸送機構
微小管上の輸送は、モータータンパク質としてはキネシンとダイニンが担当しているが、細胞中心部から細胞膜周辺への分泌小胞輸送機構を明らかにするために、キネシンの発現について調べたところ、KIF1A、KIF2、KIF3Aの発現が明らかとなった。
現在、RNAiを用いた各KIFのノックダウン株の作成を行っている。KIF3Aのノックダウンによって若干のエクソサイトーシスの阻害が認められた。
また、現在分泌小胞とKIFをつなぐタンパク質として、免疫沈降法によってKAP3およびRabタンパク質を網羅的に解析している。
(2)マスト細胞におけるアクティブゾーンタンパク質ELKSの発現と機能解析
神経細胞のアクティブゾーンタンパク質であるELKSは、同じくアクティブゾーンタンパク質であるbassoon、piccolo、RIMと結合し、極めて重要な役割を果たしている。そこで、まずマスト細胞での発現を確認したところ、RT-PCRおよびウエスタンブロットによってその発現が確認された。次にRNAiでELKSをノックダウンしたところ、50%程度の発現低下では、エクソサイトーシスに有意の減少は認められなかった。今後、さらに発現を落として、エクソサイトーシスや分泌小胞の動態を追究する。
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