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2005 年度 実績報告書

Holliday構造DNAの分岐点移動反応の顕微鏡による直接観察

研究課題

研究課題/領域番号 17049029
研究機関(財)東京都医学研究機構

研究代表者

原田 慶恵  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 副参事研究員 (10202269)

研究分担者 三木 俊明  (財)東京都医学研究機構, 東京都臨床医学総合研究所, 研究員 (10239204)
キーワード1分子計測 / 生物物理 / 分子モーター
研究概要

DNAの相同組換えの過程では十字型構造をしたHolliday構造DNAが形成され、この十字型分岐点の移動により組換えが進行する。分岐点移動反応にはRuvABタンパク質複合体が関与する。RuvAはHolliday構造に特異的に結合するタンパク質である。RuvBは六量体のリング構造を形成し、RuvAを両側から挟むようにしてRuvAと相互作用する。分岐点の移動はRuvBのATP加水分解エネルギーを利用して行われる。RuvAB複合体によるDNA相同組換えの機構を詳細に解析することを目的として、光学顕微鏡下でHolliday構造DNAの分岐点移動を直接観察する系を開発した。
Holliday構造DNAの一端をガラスに固定し、反対側の端に磁気ビーズを付け、RuvABによる分岐点移動時におこることが予想されているDNAの回転をビーズの回転運動として、顕微鏡下で観察することにした。溶液中にRuvABとATPを加えると、予想通りビーズの回転が観察された。ATP濃度を変えて、ビーズの回転を観察した結果、ATP濃度依存的に回転速度の上昇が見られた。Vmax、Kmはそれぞれ1.57回転/秒、65□Mであった。Holliday分岐点がDNA1ピッチ分(10.4bp)進む間にビーズは2回転するはずなので、回転速度から見積もったVmaxは8.2bp/秒である。同じ条件下で、生化学実験から得られたRuvABによる分岐点移動反応の速度は、低濃度ATPにおいては1分子解析で求めた速度とほぼ一致した。このことから、DNAの回転がビーズの回転に正しく伝えられていることが示唆される。しかし、生化学実験で得られたVmaxは20.5bp/秒で、1分子解析の結果の約2.5倍であった。この結果はDNAにつけたビーズが抵抗となることで、分岐点移動の速度が遅くなっていることを示唆している。

  • 研究成果

    (10件)

すべて 2006 2005 その他

すべて 雑誌論文 (6件) 図書 (4件)

  • [雑誌論文] Development of a microscopic platform for real-time monitoring of biomolecular interactions.2006

    • 著者名/発表者名
      Sasuga, Y.
    • 雑誌名

      Genome Res. 16・1

      ページ: 132-139

  • [雑誌論文] Structure-function analysis of the three domains of RuvB DNA motor protein.2005

    • 著者名/発表者名
      Ohnishi, T.
    • 雑誌名

      J.Biol.Chem. 280・34

      ページ: 30504-30510

  • [雑誌論文] 分子イメージングによる分子間相互作用解析法の開発2005

    • 著者名/発表者名
      貴家康尋
    • 雑誌名

      バイオテクノロジージャーナル 5・3

      ページ: 303-305

  • [雑誌論文] ビーズを用いた生体分子間相互作用解析技術の開発.2005

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 雑誌名

      BIO INDUSTRY 22・10

      ページ: 66-74

  • [雑誌論文] Microbead Arrays2005

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 雑誌名

      The Japan Journal September

      ページ: 27

  • [雑誌論文] 1個の生体分子の運動を観る2005

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 雑誌名

      総研大ジャーナル 8

      ページ: 13-15

  • [図書] ソフトナノテクノロジー -バイオマテリアル革命-2005

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 総ページ数
      11
    • 出版者
      シーエムシー出版
  • [図書] 細胞生物学実験法 III 細胞解析法-IV2005

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 総ページ数
      12
    • 出版者
      廣川書店
  • [図書] 生物物理学ハンドブック DNA, RNAポリメラーゼ

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 出版者
      朝倉書店(印刷中)
  • [図書] ナノバイオ辞典 一分子観察,蛍光顕微鏡,蛍光色素,光ピンセット

    • 著者名/発表者名
      原田慶恵
    • 出版者
      テクノシステム(印刷中)

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公開日: 2007-04-02   更新日: 2016-04-21  

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