DNA複製装置レプリソーム超複合体の再編による機能変換

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17053018
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 石野 良純 九州大学, 大学院農学研究院, 教授 (30346837)
• 研究分担者: 真柳 浩太 長浜バイオ大学, 生命情報科学コース, 博士研究員 (50418571)
• キーワード: DNA複製 / 組換え修復 / アーキア / 超好熱菌 / レプリソーム複合体

研究概要

DNA複製はフォーク構造DNAと蛋白質複合体から構成されるレプリソームと呼ばれる超分子複合体が正しく機能することによって進行する。我々はこのレプリソーム構成蛋白質因子間の相互作用様式を理解することを目的として、複合体としての構造解析を進めた。蛋白質の構造解析技術が急速に進歩したとは言え、複製の進行に伴って時々刻々と変化するレプリソームの構成蛋白質を構造解析のために安定な複合体として単離するのはそう容易なことではない。我々の研究の特徴は、原核生物でありながらその複製、修復関連蛋白質が真正細菌のものよりも真核生物のものにより類似している古細菌由来の蛋白質を用いていることにある。古細菌の中でも超好熱古細菌由来の蛋白質は特に安定性に優れ、複合体としての構造解析にとって最も適した実験材料であると考えられる。我々は、超好熱古細菌Pyrococcus furiosus由来の蛋白質因子を用いて種々のDNA複製、修復複合体解析を進めた。連続的なDNA鎖合成のために必要なクランプ分子をDNA鎖上に乗せるクランプローディングという現象を理解するためにPCNA(クランプ)-RFC(クランプローダー)-DNA複合体の三次元構造を電子顕微鏡の単粒子解析によって解析した。その結果は大変興味深いことに環状のPCNAがRFCとの結合によって開いた状態の中間状態を観察することができ、クランプ環の開き方に関して大変重要な知見を得た。また、同様の手法を用いてPCNA-DNAポリメラーゼ複合体、PCNA-DNAリガーゼ-DNA複合体などの構造解析を進めており、複合体の単離と電顕観察像の取得に成功した。
複製フォークが正しく進行しないときに働くと考えられる修復機構のためにレプリソームが再編されることが予想されるが、我々は複製フォークに特異的に働くP.furiosus由来のHjmヘリカーゼがPCNAと結合して複合体を形成することを見出し、それがヘリカーゼ単独の場合よりも活性が高いことが分かった。そこで、この複合体の構造解析を目指して安定な複合体を単離する条件検討を行った。

研究成果

• [雑誌論文] Stoichiometric complex fromation by proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and its interacting protein : purification and crystallization of the DNA polymerase and PCNA monomer mutant complex from Pyrococcus furiosis (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Acta Cryst F62 ページ: 253-256
• [雑誌論文] Comprehensive search for DNA polymerase in the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Nucleoseides, Nucleotides, and Nucleic Acids (印刷中)
• [雑誌論文] Structure-specific DNA nucleases : structural basis for 3D-scissors (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Curr.Opin.Struct.Biol 16 ページ: 1-8
• [雑誌論文] Mechanisms of Maintaining Genetic Stability by Homologous Recombination (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Chem Rev 106 ページ: 324-339
• [雑誌論文] Crystal structure and functional implications of Pyrococcus furiosus Hef helicase domain involved in branched DNA processing (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Structure 13 ページ: 143-153
• [雑誌論文] Identification of a novel helicase activity unwinding branched DNAs from the hyperthermophilic archaeon, Pyrococcus furiosus (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280 ページ: 12351-12358
• [雑誌論文] Structural and functional analyses of an archaeal XPF/Rad1/Mus81 nuclease : asymmetric DNA binding and cleavage mechanisms (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Structure 13 ページ: 1183-1192
• [雑誌論文] Identification of the critical region in Replication factor C from Pyrococcus furiosus for the stable complex formation with proliferating cell nuclear antigen DNA (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Genes Genet.Syst 80 ページ: 83-93
• [雑誌論文] Expression and molecular characterization of spherical particles derived from the genome of the hyperthermophilic euryarchaeote Pyrococcus furiosis (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: J Biochem 138 ページ: 193-199
• [雑誌論文] Overproduction, purification and crystallization of an archael DNA ligase from Pyrococcus furiosus (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Acta Cryst F61 ページ: 1100-1102
• [雑誌論文] Open clamp structure in the clamp-loading complex visualized by electron microscopic image analysis (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Proc Natl Acad Sci USA 102 ページ: 13795-13800
• [雑誌論文] The archaeal Hjm helicase has recQ-like functions, and may be involved in repair of stalled replication fork (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: Genes Cells 11 ページ: 99-110
• [雑誌論文] DNA複製、修復研究から遺伝子解析技術開発へ (2005)
  • 著者名/発表者名: Ishino, Y., et al.
  • 雑誌名: DNA多型 13 ページ: 1-13