| 研究課題/領域番号 |
17054004
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| 研究機関 | 筑波大学 |
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研究代表者 |
深水 昭吉 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 教授 (60199172)
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| 研究分担者 |
大徳 浩照 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 講師 (30361314)
廣田 恵子 筑波大学, 大学院・生命環境科学研究科, 研究員 (00375370)
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| キーワード | フォークヘッド / アルギニンメチル化 / 複合体精製 / 酸化ストレス / ユビキチン化 / E3リガーゼ / 修復 / 複製 |
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| 研究概要 |
本研究は『転写修飾を介したホメオスタシスを制御するDECODE回路』の生物学的意義を明らかにし、転写制御メカニズムの新しいパラダイムの創出を目指すため、平成19年度は以下のことを明らかにした。
(1)Foxo1アルギニンメチル化酵素の同定:PRMT1によるメチル化の生理学的意義を検討した結果、酸化ストレス耐性を発揮することが明らかになった。また、メチル化部位を同定し、部位特的な特異的抗体を作成した。
(2)Foxo1複合体形成タンパク質のスクリーニング:Foxo1にFLAGとHAタグを付した発現ベクターを作製し、HeLaS3細胞発現株を樹立した。HeLaS3樹立株を40L程度の木量培養系を確立し、Foxo1の精製方法を確立する。複合体を質量分析計で相互作用因子を同定した結果、DNA修復・複製系のタンパク質群と相互作用することが判明した。
(3)SMEK1複合体形成複合体形成タンパク質のスクリーニング:SMK1の哺乳類ホモログ・SMEK1の複合体精製を行った結果、フィスファターゼであるPPCファミリーのサブユニットと会合することが判明した。
(4)脂肪特異的Foxo1過剰発現マウスを作製し発現解析:Foxo1過剰発現している脂肪組織では、インリスン抵抗性が発症していることが判明した。
(1)非メチル化EWS変異体のコアクチベーター活性の検討:EWSのメチル化部位が多数あることが判明し、変異体の作成は困難であった。そこで、領域欠失型へに体を作成し検証したところ、RGG3ボックスが主なメチル化領域であった。
(2)ユビキチン化および分解機構の解明:WWP1がEWSのユビキチン化酵素であり、RRM領域がユビキチン化部位であることが判明した。
(3)PRMT1〜PRMT8までの基質特性の検討:EWSは、PRMT1と8によって強くメチル化されることが判明した。
(4)Argメチル化EWSに対する特異的抗体の作製:抗-EWSアルギニンメチル化抗体を作製し、細胞内でのメチル化モニタリング系を確立した。
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