| 研究課題/領域番号 |
17081016
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| 研究機関 | 杏林大学 |
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研究代表者 |
金井 好克 杏林大学, 医学部, 教授 (60204533)
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| 研究分担者 |
安西 尚彦 杏林大学, 医学部, 助手 (70276054)
平田 拓 杏林大学, 医学部, 助手 (60372918)
夏目 徹 独立行政法人産業技術総合研究所, 生物情報解析研究センター・タンパク質ネットワーク解析チーム, チームリーダー (00357683)
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| キーワード | 膜輸送 / トランスポーター / 複合体 / 生体膜 / 上皮輸送 / PDZタンパク質 / 蛋白質間相互作用 / 腎 |
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| 研究概要 |
本研究は、腎尿細管の有機溶質トランスポーターを中心として形成されるトランスポートソームを題材としてその分子構築と機能を明らかにすることにより、トランスポートソームの実体を明示することを目的とする。研究初年度にあたる平成17年度は、当初の研究計画通り、実験系、解析技術の確立とトランスポートソーム研究への最適化を行い、平行してトランスポートソーム実証に向けた以下の検討を行った。(1)タンデムタグによる免疫沈降の高効率化。HAタグをタンデムに連結するベクターを開発し、アミノ酸トランスポーターLAT1とタンデムHAタグの融合タンパク質を培養細胞に発現させ、抗HAタグにより免疫沈降を行い、LAT1のC-末端への結合タンパク質RACK1を高効率に共沈降して回収できる解析系を確立した。今後、本タンデムタグを用いクロスリンクによる複合体の免疫沈降に発展させる。(2)腎近位尿細管PDZネットワークにより形成されるトランスポートソームの解析。すでに、腎近位尿細管管腔側の尿酸トランスポーターURAT1が、PDZタンパク質PDZK1と連結することを示したが、本年度は、URAT1とトランスポートソームを形成すると考えられる有機アニオントランスポーターOAT4とペプチドトランスポーターPepT2が、PDZK1と連結することを明らかにした。(3)PDZ相互作用以外のタンパク質間相互作用として、上記LAT1のC-末端が、小胞体からゴルジ装置への移行に重要であることを明らかにし、ここに結合するタンパク質として、上記RACK1を同定した。(4)線虫のPDZ結合モチーフを持つアミノ酸トランスポーターの解析。線虫のcDNAを哺乳類培養細胞に発現させて機能解析を行い、GFPを当該遺伝子に連結し、線虫における発現細胞を解析した。このPDZ結合モチーフへの結合タンパク質を明らかにし、今後モデル生物としての利点を活かして、in vivoでの解析を行う。
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