研究課題
基盤研究(A)
本研究では"糖鎖提示ナノ微粒子および質量分析計"を用いることで、複合糖質の分子レベでの機能解明すなわち「相互作用相手分子を効率的に探索し、同定する新規方法論」を開発することを目的とした。〈非特異吸着抑制型水溶性糖鎖提示ナノ微粒子の作製〉本研究では、金属表面とチオール基との親和性を利用して金属ナノ微粒子表面修飾を行った。金属ナノ微粒子表面には糖鎖を〜数百分子程度提示できるため、相互作用相手分子との強い結合力が得られる(糖鎖クラスター効果)。また、アミノオキシ基と糖鎖還元末端との化学選択的反応を利用することであらゆる糖鎖を提示可能なシステムを構築した。これを利用し、糖鎖提示ナノ懲粒子のライブラリー化を行った。標的タンパク質を共有結合で捕捉可能な自殺基質型の糖鎖誘導体を微粒子表面に簡便に提示する方法の開発も合わせて行った。金属-チオール結合がレーザーによって切断されることを利用し、ナノ微粒子表面への糖鎖の提示をMALDI-TOF MSによって評価した。ナノ微粒子への非特異吸着を低減するために、双性イオン型チオール化合物を合成し、これを用いた。作製したすべてのナノ微粒子は高い水溶性および安定性を示した。〈糖鎖相互作用分子の探索および同定方法の確立〉本研究で作製したナノ微粒子は水溶性であるため、相互作用相手分子を捕捉後そのまま各種生化学的アッセイおよびMALDI-TOF MS測定に供することができる。生体試料からの相互作用相手分子(タンパク質)の捕捉においては、ナノ微粒子と試料溶液をインキュベートし洗浄後そのままSDS-PAGEにアプライし、目的のバンドを切り出してプロテオミクスの常法に従ってタンパク質の同定が可能であった。このように、競合糖鎖による溶出が必要なアフィニティークロマトグラフィー等の従来法と比較して、サンプルロスが少ないことによる高感度化、および作業工程の簡素化による大幅な效率化を達成した。
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