| 研究課題/領域番号 |
17209051
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| 研究機関 | 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター(研究所) |
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研究代表者 |
高橋 克仁 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター, 研究所, 部長 (40211338)
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| 研究分担者 |
吉川 秀樹 大阪大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (60191558)
山村 倫子 地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪府立成人病センター, 研究所, 主任研究員 (50342994)
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| キーワード | ヘルペスウイルス / カルポニン / 肉腫 / 遺伝子治療 / GMP |
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| 研究概要 |
HSV-1の産生細胞であるアフリカミドリザル腎臓細胞由来Vero細胞でのタンパク質発現系にあわせてコドンの使用頻度、GC塩基の含量などを最適化し塩基配列を設計した人工合成HSV-11CP4遺伝子(3897bp)の上流にHSV-1の内在性発現制御配列を連結し、下流にpolyA配列(74bp)、SV40エンハンサー/プロモーター、イントロン、ネオマイシン耐性遺伝子(795bp)、イントロン、PolyA配列の順で連結したDNAを全人工合成し、pHSG299ベクターにクローニングした。エンドトキシン試験及び無菌試験を経た人工合成DNAをリポフェクション法を用いて生物学的評価試験施行済みの129継代Vero細胞に遺伝子導入した。ICP4mRNAと蛋白を安定に発現し得るG418耐性Vero細胞を選別クローン化し、高力価のICP4欠失HSV-1を産生するシードセルストック8本(8.80x10^6/本)を作成した。続いて、シードセルストックから1本あたり6.36x10^6個の細胞を含むマスターセルバンク100本を無菌環境下で作成した。ニュージーランド製FBSを含め全ての培養用試薬・培地は、品質試験を経たものを用いた。Real-time PCR法でマスターセルバンクのリボヌクレオチド還元酵素及びICP4 mRNAの発現を定量し、無血清培養条件での細胞特性を解析した。
ウイルスを試験薬として製造する場合その規格を統一することが必要であり、そのためにはウイルスの単一クローンから均一なゲノムDNAを精製することが好ましい。それにより塩基配列決定の信頼性が高まる。肉腫標的破壊HSV-1ゲノムヘのBAC挿入ベクターを用いたゲノムDNAのクローニングと塩基配列決定を進めた。
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