| 研究課題/領域番号 |
17310127
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| 研究機関 | 京都工芸繊維大学 |
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研究代表者 |
柄谷 肇 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助教授 (10169659)
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| 研究分担者 |
和田 実 東京大学, 海洋研究所, 助手 (70292860)
佐々木 健 京都工芸繊維大学, 繊維学部, 助教授 (20205842)
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| キーワード | 生物発光 / 微生物ルシフェラーゼ / 蛍光タンパク質 / 蛍光イメージング / 遺伝子クローニング / 遺伝子発現 / 細胞分裂周期 / 呼吸 |
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| 研究概要 |
1.微生物発光変調の時間過程に関する検討微生物細胞内の発光変調関連タンパク質の偏在性を蛍光イメージング法に基づいて調べた結果、蛍光タンパク質(YFP及び:Y1-BFP)及び過渡的蛍光性ルシフェラーゼ中間体は細胞膜近傍に存在すること、且つ呼吸活性と連動していることを明らかにした。二次元電気泳動法及びスペクトロスコピーに基づく実験から、微生物の成長過程において、YFP及びY1-BFPは同期して発現すること、発光変調の時間過程と対応すること、またYFP及びY1-BFPの発現はルシフェラーゼの発現と同期していないことを明らかにした。また発光変調が細胞分裂周期に依存する現象であることを示唆した。
2.YFP及びY1-BFP遺伝子発現系の確立:YFPをコードする遺伝子(YFP遺伝子とよぶ)をインサートとして有するベクター(pETBlue-2)の調製法を構築した。YFPの発現はコンピテントセル(BL21)を用い、形質転換にはヒートショック法を採用した。発現誘導物質の添加条件を詳しく調べ、主にウエスタンブロッティング法により発現を検証した結果、最適発現条件を確立した。Y1-BFPをコードする遺伝子(Y1-BFP遺伝子とよぶ)については、インバースPCR法によって全塩基配列のシーケンスを達成し、塩基長が600bであることを明らかにした。さらに、Y1-BFP遺伝子をクローニングしたプラスミドベクタターの調製法を確立し、これを用いるBL21の形質転換と発現法を確立した。特に、YFPについては、形質転換大腸菌の蛍光イメージングから、in vivoにおいて機能発現が達成されることを確認した。
3.今後、発光微生物ゲノム遺伝子における発光変調関連遺伝子の構造解析、及び発光変調に係わる全遺伝子を有する組換えDNA分子の構築と形質転換大腸菌による発光変調関連タンパク質の発現リズムを詳しく調べる。
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