| 研究課題/領域番号 |
17370026
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
道端 齊 広島大学, 大学院・理学研究科, 教授 (00111740)
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| 研究分担者 |
植木 龍也 広島大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (10274705)
廣田 洋 理化学研究所, 蛋白質構造・機能研究グループ, 副ディレクター(研究職) (00126153)
濱田 季之 理化学研究所, 蛋白質機能研究チーム, 研究員 (40321799)
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| キーワード | ホヤ / バナジウム / 金属結合タンパク質 / 立体構造 / 細胞培養 |
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| 研究概要 |
ホヤの高選択的かつ高濃度のバナジウム濃縮機構のカギを握るバナジウム結合タンパク質に関して、細胞内外での局在と機能分担の解明を行なうとともに血球の培養系を確立することを目指し、以下のとおり実施した。
1.特異的モノクローナル抗体を用いてスジキレボヤの4種のVanabinのバナドサイト内部での局在をウェスタンブロットおよび共焦点蛍光顕微鏡で調べた。Vanabin4は細胞膜にゆるく結合していることを示唆する結果が得られた。
2.ファーウェスタン法およびTwo-hybrid法によってVanabinと相互作用する新規タンパク質VIP1を同定した。VIP1および5種類のVanabin間の相互作用を検証した。また、ゲルろ過カラムを用いてVanabin相互間の金属受け渡しの解析を行なった。
3.スジキレボヤの成体の腸管付近の間充織細胞と血球、幼生の胴部間充織細胞から細胞株の樹立を試みた。ホヤ血清などの種々の増殖因子や栄養素の添加によって、より長期の培養と増殖細胞の株化を試みた。
4.成体の血球の初代培養系に対して種々の核酸の導入を試みた。リポフェクション法およびポリアミン法によってある種の血球にプラスミドDNAを導入することに成功した。
5.Vanabin2の実測データを基準とし、ホモロジーモデリング法によってスジキレボヤ4種およびカタユウレイボヤ5種のVanabinの立体構造の推定を行なった。得られた結果から各Vanabin間のバナジウム結合部位の違いを検討した。
6.高純度のVanabin2およびVanabinPタンパク質を大量調製し、結晶化を試みた。
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