アスパルテーム合成の高効率化を目的とするサーモライシンの蛋白質工学と反応制御工学

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17380065
• 研究機関: 京都大学
• 研究代表者: 井上 國世 京都大学, 農学研究科, 教授 (10223249)
• 研究分担者: 保川 清 京都大学, 農学研究科, 助教授 (30397559) ; 滝田 禎亮 京都大学, 農学研究科, 助手 (70263126)
• キーワード: 酵素 / 蛋白質工学 / 反応制御 / ペプチド / 食品

研究概要

サーモライシン(以下TLNと略す)は高濃度の塩の添加により十数倍も活性が上昇する。低塩濃度下での低活性型から高塩濃度下での高活性型に移行する分子機構を検討するため、4M NaCl存在下でのX線結晶解析を行なった。大きい構造変化は認められなかったが、NドメインとCドメインの間がやや開くことが認められ、これが活性化に関与する可能性が示された。われわれはTLNの天然型変異体としてTa(Val140Ala)とTb(Ala73Val)を見出している。変異型Taで140位のバリンがアラニンに変換されている。これは、野生型TLNに比べ、好塩性とZAPM合成能が上昇した。Tbでは73位のアラニンがバリンに変換されており、これは野生型酵素に比べZAPM合成能が低下した。蛋白質分解活性はTaで低下、Tbで上昇した。このような基質特異性の変化をもたらす構造因子を解明し、TaとTbの構造を野生型TLNの構造と比較するためにX線結晶解析を行なった。三者の間に明確な構造上の差異を見出せず、酵素機能の発現が極めて微小の構造変化に支えられていることを確認した。われわれは、活性部位にあるZnから20Å以内で水との接触率が20%以上のセリン残基8個をアスパラギン酸またはリジンに変換し、電荷を導入し、好塩性に対する分子表面静電場の効果を検討した。Ser53AspおよびSer65Asp変異体は高い熱安定性を示した。分光学(吸光度、蛍光、円二色性スペクトル)を用いて、この安定化の原因を検討した。さらにTLN分子表面と活性部位残基の改変による活性の増強、アスパルテーム合成反応中における原料と生成物の安定化を目的にTLNの至適pHの酸性域への拡大、TLNの長時間の活性保持を目的に自己消化の抑制と安定化を達成した。

研究成果

• [雑誌論文] Characterization of Glt-D-Phe, Gly-L-Leu, and D-Phe as affinity ligands to thermolysin. (2006)
  • 著者名/発表者名: Yasukawa, K., Kusano, M., Nakamura, K., Inouye, K.
  • 雑誌名: Protein Expression and Purification 46 ページ: 332-336
• [雑誌論文] Dissociation/association properties of a dodecameric cyclomaltodextrinase. Effects of pH and salt concentration on the oligomeric state. (2006)
  • 著者名/発表者名: Lee, H.-S., Kim, J.-S., Shim, K., Kim, J.-W., Inouye, K.etc.
  • 雑誌名: FEBS J 273 ページ: 109-121
• [雑誌論文] Extracellular production of recombinant thermolysin expressed in Escherichia coli, and its purification and enzymatic characterization. (2006)
  • 著者名/発表者名: Inouye, K, Minoda, M, Takita, T, Yasukawa, K, etc.
  • 雑誌名: Protein Expression and Purification 46 ページ: 248-255
• [雑誌論文] Anomalous pH-dependence of the activity of human matrilysin (matrix metalloproteinase-7) as revealed by nitration and amination of its tyrosine residues. (2005)
  • 著者名/発表者名: Muta, Y., Oneda, H., Inouye, K.
  • 雑誌名: Biochem.J. 386(2) ページ: 263-270
• [雑誌論文] Metabolism of 26,26,26,27,27,27-F6-1a,23S,25-trihydroxyvitamin D3 by human UDP-glucuronosyltransferase 1A3. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kasai, N., Sakaki, T., Shinkyo, R., Kamao, M., Ohta, M., Inouye, K.etc.
  • 雑誌名: Drug Metabol.Dispos. 33(1) ページ: 102-107
• [雑誌論文] Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsumura, K, Saito, T., Kugimiya, W., Inouye, K etc.
  • 雑誌名: Food Sci.Technol./LWT 38(3) ページ: 255-261
• [雑誌論文] Metabolism of vitamin D3 by cytochromes P450. (2005)
  • 著者名/発表者名: Sakaki, T., Kagawa, N., Yamamoto, K., Inouye, K.
  • 雑誌名: Frontiers in Bioscience. 10(1) ページ: 119-134
• [雑誌論文] Evidence of the occurrence of membrane-type serine protease 1/matriptase on the basolateral sides of enterocytes. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsuzuki, S., Murai, N., Inouye, K., Iwanaga, T., Fushiki, T etc.
  • 雑誌名: Biochem.J. 388(2) ページ: 679-687
• [雑誌論文] Emulsifying properties of a peptide from peptic hydrolysates of soy glycinin. (2005)
  • 著者名/発表者名: Tsumura, K., Kugimiya, W., Inouye, K.
  • 雑誌名: Food Sci.Technol.Res. 11(1) ページ: 46-51
• [雑誌論文] Preliminary X-ray crystallographic analysis of thermolysin in the presence of 4 M NaCl. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kamo, M., Inouye, K., Tanokura, M.
  • 雑誌名: Acta Crystallographica D 61(6) ページ: 710-712
• [雑誌論文] Measurement and characterization of C-3 epimerization activity toward vitamin D3. (2005)
  • 著者名/発表者名: Kamao M., Hatakeyama, S., Inouye, K., Kubodera, N., Reddy, G.S etc.
  • 雑誌名: Arch.Biochem.Biophys. 436(1) ページ: 196-205
• [雑誌論文] Identification of amino acid residues of CYP27B1 responsible for binding of 25-hydroxyvitamin D3 whose mutation causes vitamin D3-dependent rickets type I. (2005)
  • 著者名/発表者名: Yamamoto, K., Uchida, E., Kato, S., Inouye, K., Yamada, S etc.
  • 雑誌名: J.Biol.Chem. 280(34) ページ: 30511-30516
• [雑誌論文] Catalytic properties of an organic solvent resistant tyrosinase from Streptomyces sp. REN-21 and its high-level production in Escherichia coli. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ito, M., Inouye, K.
  • 雑誌名: J.Biochem. 138(4) ページ: 355-362
• [雑誌論文] Identification of a novel cytotoxic proteins, Cry45Aa, from Bacillus thuringiensis A1470 strain and its selective cytotoxic activity against various mammalian cell lines. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okumura, S., Saitoh, H., Ishikawa, T., Mizuki, E., Inouye, K etc.
  • 雑誌名: J.Agric.Food Chem. 53(16) ページ: 6313-6318
• [雑誌論文] Metabolism of 2a-propexy-1a, 25-dihydroxyvitamin D3 by human CYP27A1 and CYP24A1. (2005)
  • 著者名/発表者名: Abe, D., Sakaki, T., Kusudo, T., Kittaka, A., Ohta, M., Inouye, K etc.
  • 雑誌名: Drug Metabolism and Disposition 33(6) ページ: 778-784
• [雑誌論文] Mutational effect for stability in a conserved region of thermolysin. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsumiya, Y., Nishikawa, K., Inouye, K., Kubo, M.
  • 雑誌名: Lett.Appl.Microbiol. 40 ページ: 329-334
• [雑誌論文] Rat cytoichrome P450-mediated transformation of dichlorodibenzo-p-dioxins by recombinant White-rot basidiomycete Coriolus hirsutus. (2005)
  • 著者名/発表者名: Orihara, K., Yamazaki, T., Inouye, K., Tsukamoto, A., Shishido, K etc.
  • 雑誌名: Appl.Microbiol.Biotechnol. 69 ページ: 22-28
• [雑誌論文] Determination of biotinylated proteins as an index for purification of plasma membrane using surface plasmon resonance-based optical biosensor. (2005)
  • 著者名/発表者名: Okumura, S., Akao, T., Yamashita, S., Ichimatsu, T., Inouye, K.
  • 雑誌名: Cytotechnology, 47 ページ: 59-67
• [雑誌論文] Distribution, structure, organ-specific expression and phylogenic analysis of the PR-3 chitinase gene family in rice (Oryza sativa L.).
  • 著者名/発表者名: Nakazaki, T., Tsukiyama, T., Okumoto, D., Inouye, K.etc.
  • 雑誌名: Genome (印刷中)
• [雑誌論文] Purification and characterization of a D-fructose-1,6-bisphosphate aldolase from red alga, Gracilaria chorde Holmes.
  • 著者名/発表者名: Kakita, H., Kamishima, H., Inouye, K.
  • 雑誌名: Marina Botanica (印刷中)
• [雑誌論文] Efficient solubilization, activation, and purification of recombinant Cry45Aa of Bacillus thuringiensis expressed as an Escherichia coli inclusion body.
  • 著者名/発表者名: Okumura, S., Saitoh, H., Higuchi, K., Mizuki, E., Inouye, K etc.
  • 雑誌名: Protein Expression and Purification (印刷中)
• [図書] 入門 酵素と補酵素の化学(原著:T.D.H.Bugg : Introduction to Enzyme and Coenzyme Chemistry, 2nd Edition, Blackwell, Oxford, UK, 2004, ISBN 1-4052-5 ; pp.292) (2006)
  • 著者名/発表者名: 井上國世(翻訳)
  • 総ページ数: 320
  • 出版者: シュプリンガー・フェアラーク東京
• [図書] 酵素ハンドブック(第3版) (2006)
  • 著者名/発表者名: 井上國世(共著)
  • 出版者: 朝倉書店(印刷中)
• [図書] 機能性糖質素材の開発と食品への応用 (2005)
  • 著者名/発表者名: 井上國世(監修)
  • 総ページ数: 447
  • 出版者: シーエムシー出版
• [図書] 総論-糖質の機能-、「機能性糖質素材の開発と食品への応用」(井上國世監修) (2005)
  • 著者名/発表者名: 井上國世(共著)
  • 総ページ数: 3-23
  • 出版者: シーエムシー出版
• [図書] グルコシル化アスコルビン酸の製造と食品の抗酸化作用、「機能性糖質素材の開発と食品への応用」(井上國世 監修) (2005)
  • 著者名/発表者名: 井上國世(共著)
  • 総ページ数: 284-294
  • 出版者: シーエムシー出版