研究課題
基盤研究(B)
サーモライシン(TLN)は高い活性と広い基質特異性をもつ中性金属プロテアーゼである。好熱性酵素であり、至適温度は70℃、熱失活のT_<50>は87℃である。好塩性酵素でもあり、TLN活性は高濃度の中性塩の濃度増大に対し活性は指数関数的に増大し、4MNaClでは13倍になる。TLNはアスパルテーム合成に利用されてきたが、さらなる活性と安定性の向上が望まれている。1.TLNの分子表面にあり活性部位から離れた位置にある7個のSerを個別にAspに変換し負電荷を導入した。7種の変異体の活性は野生型TLN(WT)に匹敵し、うち6種では4MNaClでの活性が17-19倍となった。10mMCa^<2+>存在下、85℃で30分間処理したとき、WTの残存活性は51%であるが、Ser53とSer65をAspに変換したS53DとS65Dでは78と63%であり、変異導入により熱安定性が増大した。S53Dは熱変性の活性化エンタルピー変化の増大、S65Dは活性化エントロピー変化の減少により安定化されたことが示された。2.WTは100mMCa^<2+>存在下にS53DやS65Dと同程度の安定性を示したことから、低Ca^<2+>濃度でのS53DとS65Dの高安定性は、Ca^<2+>がAsp53や65に結合することに起因すると判断した。活性部位底のLeu144をSerに変換したL144S、N末端にS-S結合を導入した三重変異体G8C/N60C/S65P、両変異を包含した四重変異体G8C/N60C/S65P/L144SはWTに比べて5-10倍活性化し、熱安定性も増大した。四重変異体の安定化は個別にもたらされた安定化の相加として解釈できた。3.TLNの自己消化部位をGly154-Leu155と同定した。Leu155をAlaに変換したL155Aでは90℃での失活時間が4倍増大した。4.4MNaCl存在下でのTLNの結晶構造解析を行ったところ、NaCl非存在下の構造に比べて、NドメインとCドメインが1.5Å開いた構造を取っていた。5.TLN生産菌変異株から低分子基質分解に優れたTLN変異体A73Vと蛋白質基質分解に優れたV140Aを分離した。A73VはAPM合成に優れた成績を示した。以上の5点の研究から、安定性と活性に優れたTLNを創出でき、所期の目的を達成できた。
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