| 研究課題/領域番号 |
17380200
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
松田 幹 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 教授 (20144131)
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| 研究分担者 |
灘野 大太 名古屋大学, 大学院・生命農学研究科, 助教授 (00228074)
佐藤 ちひろ 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 助教授 (10343211)
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| キーワード | 卵膜 / 透明体 / Zona Pellucida / 受精 / ZPドメイン |
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| 研究概要 |
平成17年度は、卵膜側の精子活性化分子群について、これらの機能の発現を担う領域や構造を解明するための実験に必要なサンプルの大量調製を中心に進めた。
精子活性化能を持つZPDおよびZP1は分子内に潜在的N-型糖鎖結合サイトが4および3カ所存在する。いずれの糖タンパク質も等電点電気泳動により5-10程度の荷電の異なるスポットに分離することから、シアル酸や硫酸基を持つ糖鎖が存在し、精子膜上の分子との結合とそれに続く精子の活性化に糖鎖が何らかの役割を果たしている可能性がある。そこで、以下のように卵胞の卵母細胞を採取し、そこから卵膜を分離してZP1、ZPCおよびZPDを大量に調製した。
(1)卵膜の分離・調製:産卵鶏を屠殺後、卵巣を摘出し、保温したPBS中で洗浄した。卵胞にカミソリで切り込みを入れ、卵胞内の卵母細胞をPBS中に放出させた。実体顕微鏡下で卵母細胞の周囲を覆う卵膜/顆粒膜細胞層/基底膜で構成される複合層をピンセットで剥離した。
(2)卵膜ZP-糖タンパク質の分画:分離した卵膜をPBS中で超音波処理にすることより破砕し、遠心分離により沈殿(主にZP1/ZPC複合体)と上清(主にZPD)に分画した。
また、動物培養細胞を用いて、組換えZPCおよびZPDを発現させるために、発現用遺伝子コンストラクトを構築した。これらの遺伝子をCOS-7細胞に導入して発現させ、培養上清から特異抗体を用いた免疫沈降によりZPCおよびZPDを回収してWestern blotting解析を行った。その結果、ZPC、ZPDいずれもプロセッシングを受けた成熟型タンパク質として分泌されることが明らかとなった。
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