| 研究課題/領域番号 |
17380200
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
松田 幹 名古屋大学, 大学院生命農学研究科, 教授 (20144131)
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| 研究分担者 |
灘野 大太 名古屋大学, 大学院生命農学研究科, 助教授 (00228074)
佐藤 ちひろ 名古屋大学, 生物機能開発利用研究センター, 助教授 (10343211)
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| キーワード | 生殖 / 蛋白質 / 糖鎖 / 発生・分化 / 応用動物 |
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| 研究概要 |
今年度は、卵膜側の精子活性化分子群について、これらの機能発現を担う領域と構造を解明するための実験を中心に進めた。これまでの研究により、卵膜から分離したZPB1と2PCの複合体では、一部が分子間のジスルフィド結合により会合しており、この複合体が精子活性化能を持つことを明らかにしている。そこで、HA-tag付加ZPCの発現用遺伝子コンストラクトをCOS7細胞に導入し、発現・分泌を確認した後、この組換えZPCと産卵鶏血清中のZPB1をin vitroで反応させた。その後、ZPB1に対する3種のモノクローナル抗体を用いて免疫沈降を行った。沈降物をSDS-PAGE/免疫プロット法により解析した結果、ZPB1とともにZPCが共沈降しており、ZPB1とZPCが特異的に会合することが明らかになった。この結果は、ZPCに対する特異抗体および抗HA抗体によってZPB1が特異的に沈降することでも確認された。さらに、免疫沈降物を非還元状態で解析すると、約200kDaの抗ZPB1抗体陽性のバンドが検出された。これは、卵胞で卵膜が形成される場合と同様に、in vitroにおいても、ZPB1とZPCの複合体の一部が分子間ジスルフィド結合により2量体を形成することを示しており、このような部分的なジスルフィド結合形成の制御機構に興味が持たれた。一方、組換えZPCを発現分泌するCOS7細胞の培養上清に産卵鶏血清のZPB1を添加し、培養した後、ZPB1およびZPCに対する特異抗体で免疫染色し蛍光顕微鏡で観察すると、細胞表面に両者が共局在し、あたかも卵子の表面に卵膜が形成されるように、COS7細胞の表面にZPB1/ZPC複合体のマトリクスが形成されることが示唆された。これは、卵巣卵母細胞での卵膜形成機構をin vitoで解析する優れたモデル系となることが期待される。
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