| 研究概要 |
細菌感染による敗血症ショックは,自然免疫系のMD-2タンパク質が細菌のリポ多糖(LPS)を認識し,細胞表面の受容体Toll-Like-Receptor(TLR)4に認識情報を伝達することにより惹起される。研究では,これらタンパク質によるLPS認識応答の構造的な要因などをX線結晶構造解析によって明らかにするため,これらタンパク質の発現,性状解析と結晶化を行った。
ヒトMD-2については,メタノール資化性酵母Pichia pastorisにより大量のタンパク質を発現でき,付加されているヘテロなN結合型糖鎖を均一に短鎖化し,高純度に精製した。精製試料のゲル濾過クロマトグラフィーでは,排除限界付近に溶出する高分子量画分が大部分で,単量体に相当する溶出画分は1%程度と少なかった。マウスMD-2についても発現させたが,その性状はヒトのもと同じであった。
単量体画分は,LPSやリピッドAなどのリガンドと結合すること,また,LPSを認識してTLR-4を細胞レベルで活性化することなどを確認した。
ヒト試料の結晶化を重点的に進め,十分なX線回折能を有する単結晶を得ることができた。重原子同型置換結晶の調製・探索を経て,結晶のX線回折強度データを収集した。
ヒトTLR-4については,細胞外ドメインの全長(約610アミノ酸残基)の発現を目指した。細胞内発現と細胞外分泌発現のためのコンストラクトを各種作製したが,P.pastorisでは発現は認められなかった。そこで,MD-2と相互作用すると考えられるアミノ末端側の領域を発現させることとした。その結果,アミノ末端側54番目の残基までと203番目までの残基までのポリペプチド鎖を発現させることができた。今後は,異なる真核細胞発現系での全長体発現を試行すると伴に,これらアミノ末端側領域タンパク質の性状解析を行う計画である。
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