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これまでカルパインやカスパーゼなどのプロテアーゼの異常な活性化がアルツハイマー病を含む神経変性疾患において神経細胞死を引き起こすことが示されてきたが、ほとんどの研究が剖検脳や実験動物脳でこれらプロテアーゼ活性を測定することやモデル基質蛋白質の分解を指標にして議論しているに過ぎない。また、実際にADや多くの神経変性疾患で誘起される神経細胞死にどのような蛋白質の分解が決定的要因になるのか確たる証拠は提出されていない。本研究では、カルパイン活性が恒常的に上昇している内因性カルパイン阻害蛋白質カルパスタチンの遺伝子欠損マウスから調製しメタボィックラベリングした初代培養神経細胞を、ラジオプロテオミクスの手法を用いて神経細胞死誘発時に分解を被る蛋白質の同定を行い、カルパスタチン欠損マウスとアルツハイマー病モデルマウスを交配し、in vivoにおけるカルパイン活性化と特定蛋白質の分解および神経細胞死の因果関係の樹立を試みることを目的とした。本年度は年次研究計画に従って実験を行い、メタボリックラベリング条件、カルパイン活性化のため刺激条件(刺激物質の選択および暴露時間)、二次元電気泳動条件等の検討を行うと共に、電気泳動上の各スポットのシグナルの解析方法の樹立を図った。現在、野生型マウスおよびカルパスタチン遺伝子欠損マウス初代培養神経細胞を刺激後、タイムコースを追って調製したサンプルを二次元電気泳動し、取得した画像を解析している最中である。各スポットのシグナル強度から、野生型マウスおよびカルパスタチンノックアウトマウス間で有意な変化のあるものにつき分解速度(半減期)を求め、候補蛋白質を同定し、次年度の研究計画に沿って、in vivoモデルを用いて神経細胞死と新規同定カルパイン特異的基質蛋白質の分解との因果関係の樹立を試みる。
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