| 研究概要 |
本年度は以下の実験を実施した。
1)Nrf2蛋白質に相互作用する因子の同定
Nrf2による転写調節に協調的に働く共役因子を同定するために,Nrf2の活性化ドメインであるN末端領域に、ヒスチジンタグとフラッグタグで二重標識した蛋白質を大腸菌に発現させて精製した。この蛋白質を用いて、Nrf2のN末端領域に特異的に相互作用するタンパク質をHeLa細胞の核抽出液からアフィニティー精製し,TOF/MSにより蛋白質を同定した.その結果、TRRAP、TIF1β、TIF1γ、BAF53などの因子をNrf2に相互作用する因子として同定した。一過性共発現実験により解析すると、TRRAPとTIF1γはNrf2の転写活性抑制に、TIF1βはNrf2の転写活性化に働くことが明らかになった。さらに、TRRAPのノックダウン細胞を作製して解析したところ、親電子性物質によるNrf2標的遺伝子の誘導が増強していたことから、TRRAPはNrf2による転写の抑制因子であることが明らかになった。また、Nrf2を含む転写の複合体を解析するため、Nrf2に3つのフラッグ標識を連結した融合蛋白質の発現プラスミドを構築した。さらに、テトラサイクリン誘導系を用いて、標識したNrf2を安定発現するヒト細胞株を作製した。このシステムを用いて、Nrf2の転写の複合体を精製する予定である。
2)DEMに応答するレポーター遺伝子の作製
RNAiライブラリーを用いてスクリーニングを行うために、ヒトNQO1およびHO-1遺伝子のAREを含むプロモーター領域を緑色蛍光タンパク質遺伝子(EGFP)またはチミジンキナーゼ遺伝子に連結したリポーター遺伝子を構築した。今後、神経芽細胞株HT22にこれらリポーターを安定形質導入し、スクリーニングを開始する。
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