SARSコロナウイルス細胞侵入の分子機構に関する研究

2006 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 17390138
• 研究種目: 基盤研究(B)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: ウイルス学
• 研究機関: 国立感染症研究所
• 研究代表者: 田口 文広 国立感染症研究所, SARSウイルスのpseudotypeを用いた細胞侵入に関する研究及び総括, 室長 (30107429)
• 研究分担者: 松山 州徳 国立感染症研究所, SARSウイルスのS蛋白構造変化に関する分子生物学的解析, 研究員 (90373399) ; 中垣 慶子 国立感染症研究所, コロナウイルス受容体非依存性感染による病理性発現に関する研究, 流動研究員 (30421829) ; 森川 茂 国立感染症研究所, SARSウイルス・ACE2遺伝子のクローニング, 室長 (00167686) ; 石井 浩二 国立感染症研究所, ワクシニアウイルスを用いたウイルス遺伝子発現, 主任研究官 (40280763) ; 氏家 誠 国立感染症研究所, SARSウイルスペプチドを用いた解析, 研究員 (50415478)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• キーワード: SARS-CoV / S蛋白 / プロテアーゼ / 細胞侵入 / pseudotype / エンドソーム

研究概要

SARS-CoVは、受容体ACE2に結合後、エンドゾームに輸送され、cathepsin-Lなどのプロテアーゼによりスパイク(S)蛋白の膜融合能が活性化され、細胞侵入するという、エンドゾーム経路で細胞内へ侵入する。一方、我々は外来性のプロテアーゼが存在する場合、細胞表面から侵入する可能性を提唱した。この細胞表面からの侵入は、ACE2結合したS蛋白がプロテアーゼにより解裂され、膜融合活性を獲得するために可能になると考えられている。本研究では、この仮説を検証するため、解裂性S蛋白を持つpseudotypeウイルスを用いて、細胞表面からの侵入が可能か否かに付いて検討した。SARS-CoV S蛋白上の細胞内プロテアーゼ(フリン)により解裂が予想される3か所にプロテアーゼ認識アミノ酸配列を導入した変異S蛋白を作成した。このS蛋白をenvelope上に持つ水泡生口内炎ウイルス(VSV)のpseudotypeウイルスを作成し、その細胞侵入経路を検討した。3か所の変異挿入部位の中で、S蛋白797/798で解裂が起こるよう設計されたS蛋白は、細胞融合性を示し、pseudotype envelope上に発現された。このpseudotypeは、SARS-CoV非解裂性S蛋白を持つpseudotypeと比べ、エンドゾーム経由感染阻止薬による感染抑制はなく、また、SARS-CoVがエンドゾーム内で活性化されるプロテアーゼ阻害剤の影響も低かった。以上の結果から、解裂性S蛋白を持つpseudotypeは細胞表面から侵入することが強く示唆された。即ち、SARS-CoVはプロテアーゼの存在下で直接細胞膜から細胞侵入する能力を有することが確認された。
マウス肝炎ウイルス(MHV)のS蛋白のheptad repeat由来peptideは膜融合活性を阻害することでウイルス感染を阻止することが報告されている。SARS-CoVのS蛋白でも同様の実験がなされたが、MHVに比べて阻害効率が著しく悪い事が報告されている。我々は、外来性のプロテアーゼ存在下、細胞表面からの感染が可能な状態で、peptideの感染阻害効率を再評価した。この結果、細胞表面からのウイルス感染では従来考えられていたよりも低濃度のpeptideで効率よく阻害できる事が分かった。このことは、これらのpeptideが潜在的なSARS-CoVに対するinhibitorとなりえる事を示唆するもので、SARS-CoVの感染経路にpeptideをターゲティングする事でSARS-CoVの感染を効率よく阻止できる可能性を示した。

研究成果

• [雑誌論文] Evaluation of a novel vesicular stomatitis virus pseudotype-based assay for detection of neutralizing antibody responses to SARS-CoV (2006)
  • 著者名/発表者名: Fukushi S
  • 雑誌名: J Med Virol 78 ページ: 1509-1512
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Induction of protective immunity against severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) infection using highly attenuated recombinant vaccinia virus DIs (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishii K
  • 雑誌名: Virology 351 ページ: 368-380
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Receptor-independent infection of murine coronavirus : analysis by spinoculation (2006)
  • 著者名/発表者名: Watanabe R
  • 雑誌名: J. Virol 80 ページ: 4901-4908
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Evaluation of a novel vesicular stomatitis virus pseudotype-based assay for detection of neutralizing antibody responses to SARS-CoV (2006)
  • 著者名/発表者名: Fukushi S.
  • 雑誌名: J.Med.Virol. 78 ページ: 1509-1512
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Induction of protective immunity against severdse acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) infection using highly attenuated recombinant vaccinia virus DIs (2006)
  • 著者名/発表者名: Ishii K.
  • 雑誌名: Virology 351 ページ: 368-380
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Protease-mediated enhancement of SARS coronavirus infection. (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsuyama S
  • 雑誌名: Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 102 ページ: 12543-12547
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Receptor-independent spread of a highly neurotropic murine coronavirus JHMV from initially infected microglial cells in mixed neural culture (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakagaki K
  • 雑誌名: J. Virol. 79 ページ: 6102-6110
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Receptor-independent infection of murine coronavirus : analysis by spinoculation (2005)
  • 著者名/発表者名: Watanabe R
  • 雑誌名: J.Virol. 80 ページ: 4901-4908
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Protease-mediated enhancement of SARS coronavirus infection (2005)
  • 著者名/発表者名: Matsuyama S
  • 雑誌名: Proc.Natl.Acad.Sci., U.S.A. 102 ページ: 12543-12547
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Receptor-independent spread of a highly neurotropic murine coronavirus JHMV from initially infected microglial cells in mixed neural culture (2005)
  • 著者名/発表者名: Nakagaki K
  • 雑誌名: J.virol. 79 ページ: 6102-6110
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [図書] Experimental models of multiple sclerosis (2005)
  • 著者名/発表者名: Taguchi F
  • 総ページ数: 821-831
  • 出版者: Springer
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より