| 研究概要 |
'99年同胞罹患対を用いた疾患連鎖解析にて,潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患感受性遺伝子が染色体6番短腕に存在することが明らかとされた(Am J Hum Gene,1999).この染色体6番短腕(座位名: IBD3)の感受性領域は,約16Mbの広範なゲノム領域であり,直ぐに感受性遺伝子を同定できるほど狭い領域ではなっかった.そこで本申請者らはマイクロサテライトマーカーを(平均0.6Mb間隔)用いて連鎖不平衡マッピングを行い,さらにHLA, SNPをマーカーとして追加し,本疾患の感受性遺伝子座位を約0.3Mbまで絞り込むことに成功した.そこで、特定された0.3Mbのハプロタイプについて全シークエンス及び相関解析を行い,潰瘍性大腸炎の感受性遺伝子を同定することを目的とした.
平成17年度は,HLA-DRBI*1502-MICA*009-HLA-B*52- C2-4-4・allele239のハプロタイプをホモ接合にもつ日本人潰瘍性大腸炎患者2名をPool DNAとしてsample No.1,さらに前記ハプロタイプを持たないHLA-B51-C2-4-4・allclc235をホモ接合にもつ健常対照者2名をPool DNAとしてsample No.2として,この2検体について全シークエンシングを行っていた.なお基準となるreference sequenceは, HLA-DR15-Cw7-B7-A3(Genome Research 2004)とした.このDNA sampleNo.1,2を用いて, HLA-B-C2-4-4領域約0.3MbをDyeTerminator法にてすべて直接シークエンスしている.HLA-B-C2-4-4領域約0.3Mbの配列を,約600bずつのフラグメント単位に分割し,MJ Research社DNA Engine PTC-2000を用いてPCRにて増幅している.PCRプライマーの設計には,独自開発のソフトウエアを使用した.得られたPCR産物は,Millipore Multiscreen-PCRキットを用いて精製されたのち,5‘側および3'側の2方向よりシークエンスプライマーを設定し, ABI BigDye Terminatorを用いてサイクルシークエンス反応を行っている.その後, SIGMA Sephadex G50およびMillipore MultiScreen-HV, Clear platesを用いて再度精製している.最終的に得られたサンプルはApplied Biosystems社,ABI Prism 3100 Genetic Analyzerを用いて自動シークエンスを行っている.PCRよりシークエンスまでの行程は,全て96穴プレートを用いて行われ,簡便・高速・大量に処理することができるのが特徴である.平成18年度も上記作業を継続しておこなっている。
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