| 研究分担者 |
古澤 清文 松本歯科大学, 大学院・歯学独立研究科, 教授 (90165481)
李 憲起 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 助手 (60350831)
高橋 昌宏 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (90340059)
堂東 亮輔 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (40329470)
内橋 隆行 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (70397628)
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| 研究概要 |
顎下腺癌細胞(HSG)由来α-NaGalaseを精製し,ポリクローナル抗体を作製した.HSG細胞を無血清培養し,細胞抽出液および培養上清を回収した.ゲル濾過カラム,イオン交換クロマトグラフィーを用いて粗分画した蛋白をFPLCカラムで最終精製した.各分画におけるα-NaGalase活性をYamamotoらの方法で測定したところ,本蛋白はExo-α-NaGalase活性とEndoα-NaGalase活性が確認された.この蛋白分画をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で泳動し分子量を同定したところ,約50kDaの蛋白バンドが得られた.精製蛋白は,フロイントアジュバントを用いてSPFウサギに免疫し,ヒトα-NaGalaseに対する抗血清を得た.さらに,抗血清からプロテインA吸着カラムを用いて,抗α-NaGalase IgGポリクローナル抗体を得た.抗体の有用性は,抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認された.HSG細胞におけるα-NaGalaseの発現を,一次抗体を抗α-NaGalaseウサギ抗体,二次抗体として抗ウサギIgGFITC標識ヤギ抗体を用いてstreptABC法で免疫染色して観察したところ,α-NaGalaseは,細胞質ならびに核内に顆粒状に存在した.
以上の結果から,HSG由来α-NaGalaseは,Exo-α-NaGalase活性のみならずとEndoα-NaGalase活性を有する約50kDaの蛋白であると推測された.この蛋白は核内と細胞質内にも存在しており,核内移行蛋白であることが示唆された.今後は,cDNAの合成後,蛋白細胞発現ベクターを構築し,糖鎖修飾された蛋白を精製する予定である.
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