| 研究分担者 |
古澤 清文 松本歯科大学, 大学院歯学独立研究科, 教授 (90165481)
李 憲起 松本歯科大学, 総合歯科医学研究所, 助手 (60350831)
堂東 亮輔 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (40329470)
内橋 隆行 松本歯科大学, 歯学部, 助手 (70397628)
茂木 眞希雄 愛知学院大学, 薬学部, 助教授 (00174334)
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| 研究概要 |
顎下腺癌細胞(HSG)由来α-NaGalaseを精製し,ウサギに免疫して抗血清を得た。さらに,プロテインA吸着カラムを用いて抗α-NaGalase IgGポリクローナル抗体を得た。抗体の有用性は、抗原を試料としたウエスタンブロット法で確認された.HSG細胞におけるα-NaGalaseの発現を,一次抗体を抗α-NaGalaseウサギ抗体,二次抗体として抗ウサギIgGFITC標識ヤギ抗体を用いてstreptABC法で免疫染色して観察したところ,α-NaGalaseは,細胞質ならびに核内に顆粒状に存在した.唾液腺癌細胞のcDNAを作製する前に、ValidationのためにHeLa細胞を用いてZAP-cDNAライブラリーを作製した。Uni-ZAP XRライブラリーからmass-excisionを行いE.coli SOLR strainでクローニングを試みた。IPTGと温度シフトによって蛋白を発現させ、抗体によってクローニングを行った。また、レクチンを用いて脱糖鎖活性を検討した。その結果、1.ホモロジーから脱糖鎖機能を有する蛋白であると推測される、2.クローニングされたベクターで発現蛋白の回収が可能である、3.α-NaGalase活性を示す蛋白は,Exo-α-NaGalase活性のみならずEndo α-NaGalase活性を有する約50kDaの蛋白であることが明らかとなった。なお、これら抗体を用いた実験手技の妥当性はATP binding cassette transporterの抗体を用いたイムノブロットなどでvalidationを行った。今後は,唾液腺癌細胞からcDNAを作製してクローニングを行い、精製蛋白を得る予定である。
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