| 研究課題/領域番号 |
17500312
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| 研究機関 | 大阪市立大学 |
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研究代表者 |
立花 亮 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 講師 (80305614)
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| 研究分担者 |
山内 清 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (00047325)
田辺 利住 大阪市立大学, 大学院・工学研究科, 教授 (20315972)
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| キーワード | バイオマテリアル / FGF2 / BMP2 / Chitin binding domain / Cellulose binding domain |
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| 研究概要 |
(ターゲットとなるバイオマテリアルの作製)
シート状のバイオマテリアルを作製した。キチンおよびセルロースのLiClを含むジメチルアセトアミド溶液を型に流し込み、高湿度の容器に一晩放置し、ゲル化させた。このゲルをろ紙に挟んで圧縮した後、エタノールで洗浄した。さらに圧縮し、蒸留水で洗浄し、シートを得た。非常に透明性のある、柔軟で、丈夫なシートが得られた。
また、キチンの誘導体であり、水溶性のキトサンをアセチル化することによってアセチルキトサン(キチンとほぼ同等なもの)を得るという(方法である。プレートをキトサンコートし、無水酢酸を加えるだけで、キチン様表面を作製することができた。この表面はChitin binding domain(ChitinBD)によって認識されることも確認した。
(ChitinBDおよびCellulose binding domain(CelluloseBD)との融合タンパク質の作製)
融合タンパク質発現プラスミドをシーケンシャルSmaIクローニング法によって構築した。ChitinBD-BMP2は大腸菌において発現させると多くがインクルージョンボディと塗り、さらに分解産物を多く生成することがわかった。しかし、短時間での発現によって大腸菌破砕液上清に少量観察されることがわかりこれを精製し用いた。ChitinBD-FGF2,CelluloseBD-FGF2は常法により発現精製を行った。
(融合タンパク質のバイオマテリアル上での活性)
融合タンパク質がキチンおよびセルロースシートに結合することを抗FGF2抗体、抗BMP2抗体によって確認した。また、結合させたシート上で骨芽細胞を培養したところ、FGF2融合タンパク質は増殖活性を、BMP2融合タンパク質は分化誘導活性を示した。これによって、バイオマテリアルをドラッグターゲットとするシステムが構築された。
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