研究課題
DNA損傷に対する遺伝子防御機構に小胞体タンパクが関わるという報告は、これまで極めて少ない。申請者らは、アンチセンスDNA導入による発現抑制実験により、小胞体シャペロンである78-kDa glucose-regulated protein(GRP78)が、紫外線損傷DNAの修復過程に関与することにより、紫外線誘導細胞死を抑制する可能性を見いだした。本研究では、GRP78の紫外線応答への関与の詳細を解明することとし、本年度は、下記の結果を得た。1)昨年度は、紫外線損傷プラスミドを基質に用いたin vitro修復活性を構築した。この系を使用し、GRP78発現抑制細胞の全細胞抽出液ではコントロール細胞の抽出液に比べ、修復活性が低下していることを確認した。しかし、発現抑制細胞の全細胞抽出液にrecombinant GRP78(ハムスター由来)を加えても、修復活性の回復は認められなかった。本年度は、免疫沈降によりGRP78を除去したコントロール細胞抽出液の修復活性を調べたが、除去後、修復活性の低下は観察されず、逆にDNA合成の亢進とともに基質プラスミドの分解の促進が認められた。2)GRP78発現抑制細胞の全細胞抽出液ではコントロール細胞抽出液に比べ、修復酵素XPAのタンパク質量が低下していた。3)色素タンパク質GFPを融合させたGRP78-GFPタンパク質を培養ヒト細胞内に発現させ、蛍光顕微鏡下で局在を調べた。核周辺への局在が観察されたが、紫外線照射前後で顕著な局在の変化は認められなかった。以上の結果は、小胞体シャペロンGRP78の紫外線応答への関与を強く支持する。GRP78の修復過程への関与の詳細な機構は未だ不明である。しかし、上記の結果から、修復系に直接関与するのではなく、修復酵素の安定化あるいは核内代謝調節を介して間接的に関与する可能性が考えられる。
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