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本研究は、ヒト人工染色体(HAC)を新規遺伝子発現ベクターとして実用化することを目的に、遺伝子の体系的な挿入法と、レシピエント細胞への効率よい導入法の開発を課題とした。
1.目的遺伝子のHACベクターへの搭載方法の確立とその遺伝子の発現評価
大腸菌内相同組換え法であるRed/ET法を利用して、BACクローンDNAをHACベクターとの相同組換え型に改変後、Cre/lox組換え法により、様々な動物細胞内のHACベクターに特異的かつ確実に挿入する方法を開発した。その結果、BACクローン内の目的遺伝子を体系的にHACベクターに搭載する技術を確立した。次に、マウス胚性幹細胞内のHACベクターにヒトSTAT3遺伝子(200キロ塩基対)を搭載した細胞株を用いて、RT・PCR法によりHACベクターに搭載されたゲノム由来の遺伝子の発現制御を調べた。ヒトSTAT3遺伝子は内在性マウスSTAT3遺伝子と同程度の発現を示し、長期培養後もその発現は抑制されることなく、樹立時の発現量を維持した。この結果、HACベクターに搭載したゲノム由来遺伝子は、本来のゲノム染色体構造を形成し、発現制御を再現すると考えられた。
2.HACベクターの精製法と細胞導入法の開発
HACベクターを保有する細胞からの分裂期染色体の回収と、シュクロース密度勾配遠心により、HACベクターの簡易精製法を確立した。CHO細胞から精製したHACベクターは、DNAトランスフェクション法により再現的に目的のヒト培養細胞へ導入できることを明らかにした。
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