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ジベレリンは高等植物の生活環の様々なステージにおいて成長制御に関わる重要な物質であり、植物ホルモンとして広く知られている。ジベレリンは多段階の酵素反応を経て生合成されるが、生理現象の制御においては特にジベレリンの活性化と不活性化に関わる酵素が重要である。本研究においてはジベレリンの生合成の最終段階を触媒し、活性発現に直接関わる酵素であるジベレリン3β位酸化酵素蛋白をはじめ、その直前の段階を触媒するC20位酸化酵素蛋白、不活性化に関わる2β位酸化酵素蛋白を対象としてそのN末端側に存在するドメインの機能を明らかにするため、変異蛋白を設計しin vitro、in vivoの両面で酵素活性の評価を行う。平成17年度は初年度にあたるため、まずイネ及びシロイヌナズナの3β位酸化酵素遺伝子、シロイヌナズナのC20位酸化酵素遺伝子及び2β位酸化酵素遺伝子をクローニングし配列の確認を行った。次にこれらの遺伝子を融合蛋白として大腸菌で発現させて酵素活性の検定を進めている。シロイヌナズナの3β位酸化酵素遺伝子(GA4遺伝子)については活性検定の後にPCRを用いて人為的な塩基置換を導入することにより、3β位酸化酵素に共通な配列であるMWS/A/YEGY/FTモチーフのうち最も良く保存されているメチオニンとトリプトファンをそれぞれアラニンに変換した変異蛋白をコードする遺伝子を作成した。これを大腸菌で発現させて調製した蛋白の活性を検定したところ、予想に反して顕著な活性が認められた。現在結果の確認を慎重に進めるとともに、in vivoでの変異蛋白の活性評価を計画中である。またこれと平行してシロイヌナズナの2β位酸化酵素遺伝子を用い、2β位酸化酵素において高度に保存されているGWV/I/LEYLLモチーフに変異を導入するための準備を行っている。
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