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本研究では、MCM(mini chromosome maintenance)ヘリカーゼの活性化制御機構を生化学的に調べることにより、ゲノム複製開始とその制御の機構を明らかにする。MCMは6個[MCM2-7]の構造的に類似したタンパク質からなる複合体で、複製開始に必須である。MCM4-6-7複合体はDNAヘリカーゼ活性を有することから、MCMは複製フォークにおけるDNAヘリカーゼの一部として機能すると考えられている。我々はこれまでMCMヘリカーゼ活性に影響を与える種々の条件を検討し、鋳型DNA上のT-rich一本鎖DNAがヘリカーゼ活性を活性化することを報告した。
また、複製開始領域をmimicするバブル構造において、Mcm4/6/7複合体はダブルヘキサマーとして左右対称に両分岐点の5'側に隣接している25ヌクレオチドの一本鎖領域に結合することを明らかにした。片方strandのチミン残基を欠損するとDNA unwinding効力はかなり減少されることから、double-hexameric Mcm4/6/7が同時双方向にフォークを効率的に解くことを示した。ヘリカーゼ活性が3'tailのチミンの含量に関与し、最大のレベルは50%以上のチミンがあることによって達成されます。さらに、活性化されたMcm4/6/7複合体のヘリカーゼ活性がGC-richな二本鎖DNAによって阻害されることを明らかにした。
一方、MCMのクロマチン結合にはCdt1タンパク質が重要な役割を果たすことが知られている。Cdt1タンパク質は、酵母から動物細胞まで保存され、複製前複合体の形成に重要な役割を果たすことが知られている。我々は、Cdt1はMCM複合体と共免疫沈降し、特にMCM2、MCM4-6と相互作用すること、Cdt1の存在下では、Mcm4-6-7とMcm2-7複合体のDNA結合活性が促進されることを見出した。MCM4/6/7ヘリカーゼの活性はATP存在下でCdt1によって促進される。この条件下で、MCMとCdt1は分子量700kDa以上の高分子量の複合体を形成した。ATPの非存在下では、一部のCdt1はMCMと相互作用したが、その分子量は、もともとのMCM複合体と大きな違いがなかった。以上の事実は、Cdt1は大腸菌ヘリカーゼDnaBのloading因子であるDnaCと類似な機能を持つことを示す。
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