| 研究概要 |
アクチン線維の切断・脱重合因子であるコフィリンは、アクチン骨格の再構築を司る最も重要な制御因子の一つであり、LIMキナーゼとSlingshotによるリン酸化・脱リン酸化によって活性が制御されている。本研究は、細胞運動時のアクチン骨格の再構築に対するコフィリンの役割を明らかにすることを目的として、コフィリンとアクチンの結合状態を生細胞内で可視化するプローブの作製を行った。これまでに分割したGFPをコフィリンとアクチンに各々付加し、コフィリンのアクチンに対する結合活性依存的にGFPが再構成され蛍光を発色するプローブを作製していた。さらに改良の結果,コフィリンの活性依存的に10倍以上の蛍光輝度の差を持つプローブを作製することが出来た。しかし、GFPの再構成後にコフィリンを不活性化しても蛍光が退色ぜず、このプローブは可逆的な結合・解離をモニターすることが出来ないことが明らかとなった。そのため、GFPに変異を導入することによって再構成が可逆的に起こる変異体の作製を進めている。また、ここまでの成果を応用し、上記のプローブを精製しin vitroで再構成させることが可能なことを確認した。コフィリンの機能解析には、コフィリンの活性を制御するリン酸化酵素であるLIMキナーゼと脱リン酸化酵素であるSlingshotの働きを解析することが重要である。このプローブを用いることでコフィリンの活性を蛍光発色として定量出来ることから、LIMキナーゼとSlingshotの特異的阻害剤の探索を行うスクリーニング系を構築した。LIMキナーゼとSlingshotの特異的阻害剤の探索はコフィリンの細胞運動等の機能解析に重要なだけでなく、ガン転移、炎症といった疾患に対する薬剤となる可能性がある重要な研究である。阻害剤のスクリーニングを進めていくために、さらにハイスループットなスクリーニング方法の構築を進めている。
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