| 研究課題/領域番号 |
17580069
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用微生物学
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| 研究機関 | 富山県立大学 |
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研究代表者 |
加藤 康夫 富山県立大学, 工学部, 助教授 (20254237)
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| 研究分担者 |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
米田 英伸 富山県立大学, 工学部, 講師 (50285160)
青野 重利 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(岡崎統合共通研究施設), 岡崎統合バイオサイエンスセンター, 教授 (60183729)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| キーワード | アルドキシム / ニトリル / アルドキシム-ニトリル経路 / 酵素 / 遺伝子 / スクリーニング / 微生物 / 反応機構 |
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| 研究概要 |
本研究は、有機化学、酵素化学工学、蛋白質工学、微生物学等のさまざまな分野の知識・手法を総合的に駆使し、1)アルドキシム・デヒドラターゼの反応メカニズムの解明、2)アルドキシム・デヒドラターゼの多様性、3)アルドキシム-ニトリル経路の生理学的意義の解明、の3点を達成することである。当概目的を達成するために以下の検討を行った。
(1)アルドキシム・デヒドラターゼの大量供給法確立
Bacillus由来のアルドキシム・デヒドラターゼの遺伝子組換え大腸菌における高発現条件を確立し、本酵素を短時間・高収率かつ安定に迅速精製する条件を見出した。
(2)アルドキシム・デヒドラターゼの分子分光学的解析
高度に精製した本酵素を、EPR(電子スピン共鳴)、共鳴ラマン、電子吸収スペクトル等の分光学的手法により解析することで、本酵素に共通なヘムの配位状況、ヘム鉄の酸化度やスピン状態を決定し、これにより酵素反応時に関与する触媒残基の推定を行った。
(3)アルドキシム・デヒドラターゼの遺伝子スクリーニング
既知のアルドキシム・デヒドラターゼの保存領域をもとにしたオリゴヌクレオチドプライマーを用い、ハイブリダイゼーション法およびPCRにて、各種保存菌株中より本酵素遺伝子の増幅、遺伝子クローニングを行った。
(4)アルドキシム・デヒドラターゼの多様性の検討
得られた酵素遺伝子を発現させ、精製し、酵素学的諸性質を解明した。その性質と酵素蛋白の一次構造をもとに本酵素の多様性を検討した。
(5)「アルドキシム-ニトリル経路」中のニトリル分解酵素遺伝子スクリーニング
「アルドキシム-ニトリル経路」を有する菌株において、各種ニトリル分解酵素群の存在を、酵素・遺伝子的に検討した。
(6)「アルドキシム-ニトリル経路」の多様性と生理学的意義の検討
得られた酵素蛋白の一次構造をもとに本酵素の多様性を検討し、アルドキシム・デヒドラターゼの多様性と照らし合わせて、同経路の進化を考察した
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